一种基于DNAzyme与PER扩增的病毒检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种基于DNAzyme与PER扩增的病毒检测试剂盒，包括以下组分：可识别病毒靶标序列的DNA纳米器件；催化发夹；RNA报告分子；检测反应体系；所述RNA报告分子5

【技术实现步骤摘要】
一种基于DNAzyme与PER扩增的病毒检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物
，具体讲是一种基于DNAzyme与PER扩增的病毒检测试剂盒。

技术介绍

[0002]病毒是一类严重威胁着人类健康的细胞内寄生微生物，且绝大多数的人类传染病都是由病毒引起，如流感、天花、肝炎、麻疹、脊髓灰质炎、狂犬病、疯牛病、爱滋病以及最近的大流行新冠肺炎等。因而，快速、有效和灵敏的病毒检测，是目前预防、控制甚至消灭病毒的前提与基础。
[0003]传统的病毒检测技术包括直接血凝技术、聚合酶链反应(PCR)技术、基因探针技术、酶联免疫技术以及电子显微镜技术等，但这些检测方法耗时，结果不易重复，且需要有经验的技术人员。基于抗原
‑
抗体的酶联免疫吸附试验技术，由于免疫学的方法灵敏度低，不能在发病早期就检测出病毒，这样就会导致误诊，并增加了病人的负担；虽然PCR技术灵敏度高，可从痕量样品中检测出目标分子，但其开展条件要求严格，需要精密昂贵的检测仪器、实验室环境及专业操作人员，并且耗时长。
[0004]生物传感器技术相对于传统的检测方法最主要的优点是其有很高的灵敏度，能够在恒温条件下对待测靶标物质进行高灵敏的检测。这主要是由于生物传感器具有检测信号放大效应，基于信号放大的核酸检测方式主要包括两种：一种是借助工具酶的核酸扩增技术，如RCA技术、SDA技术和RPA技术等；另一种是不依赖酶信号放大技术，如催化发夹自组装反应(CHA)、杂交链式反应(HCR反应)。然而，这些核酸检测方法使用过程中，一方面对条件要求严格，需要精密昂贵的检测仪器、实验室环境及专业操作人员；另一方面需要多级热循环、复共轭性，要么需要精心设计的探针供靶标延伸。
[0005]因此，要实现病毒的感染监控，亟待研制一种特异性好，灵敏度高，方法简单，耗时短，能快速检测病毒的检测试剂盒。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在至少部分地克服现有技术中存在的上述和/或其他潜在的问题：提供一种特异性好，灵敏度高，方法简单，耗时短，能快速检测病毒的基于DNAzyme与PER扩增的病毒检测试剂盒。
[0007]本专利技术提供一种基于DNAzyme与PER扩增的病毒检测试剂盒，包括以下组分：可识别病毒靶标序列的DNA纳米器件；催化发夹；RNA报告分子；检测反应体系；
[0008]所述RNA报告分子5
‘
端标记荧光报告基团FAM，3
’
端标记荧光淬灭基团BHQ1。
[0009]所述检测反应体系包括镁离子、Bst链置换聚合酶、dNTPs、1
×
PBS缓冲液。
[0010]所述可识别病毒靶标序列的DNA纳米器件如图1所示，由病毒特异性引物寡核苷酸序列(p)与其互补寡核苷酸序列(t*+p*)通过退火处理制备而成，其中t*作用在于提供一段用于启动链置换反应的支点链，碱基数量可为5bp至10bp其中之一，p*作用在于提供引物结
合的一段互补寡核苷酸序列，碱基数量可为7bp至12bp其中之一。
[0011]所述可识别病毒靶标序列的DNA纳米器件上含有一段被封闭的病毒特异性引物寡核苷酸序列(p)，碱基数量可为7bp至12bp其中之一，待测病毒靶标寡核苷酸序列与引物互补寡核苷酸序列(t*+p*)结合，通过DNA链置换反应将引物(p)从DNA纳米器件中释放出来。
[0012]所述催化发夹具有如图2所示的结构，包括茎、环和一个引物结合位点的垂悬部分(p*)，其中茎部分的5
’
端含有一段靶标序列(A)及其寡核苷酸特异性互补的序列(A*)，碱基数量可为18bp至26bp其中之一，用于识别DNA纳米器件并引发链置换与PER反应，同时靠近环部分即茎的3
’
端含有DNA核酸酶寡核苷酸序列(D)及其寡核苷酸特异性互补的序列(D*)，用于识别与切割RNA荧光探针，并产生荧光信号。
[0013]所述催化发夹3
’
端碱基采用Inverted dT或
“‑
TTTTTTT
‑”
修饰，防止聚合酶驱动靶标核苷酸链的延伸。
[0014]所述催化发夹茎
‑
环交接区的2个碱基进行甲基化修饰，主要作用是稳定环结构以形成发夹结构，同时其引入修饰可防止聚合酶介导的链置换反应破坏发夹结构。
[0015]上述引物寡核苷酸与催化型发夹结合可触发原位级联引物交换反应，以生成含有“靶标核酸特异性引物序列+DNA核酸酶序列”的单链DNA产物，当反应体系中含有FAM/BHQ1标记的RNA报告分子时，即可产生荧光信号，实现靶标核酸信号放大检测。
[0016]本专利技术的工作原理：将具有催化RNA裂解活性的DNAzyme与引物交换反应(Primer Exchange Reaction，PER)有机相结合，通过待测靶标分子激活识别DNA纳米器件并通过链置换反应释放引物，进一步引物与催化型发夹结合后并触发PER的联级扩增效应。由PER扩增后所合成单链DNA包含5
’
端的待测靶标序列与3
‘
端的DNAzyme序列。当反应体系中含有RNA报告分子(两端分别由荧光基团FAM与淬灭基团BHQ1修饰)时，3
‘
端具有RNA裂解活性的DNAzyme能够对RNA报告分子进行切割反应，并产生荧光信号，与此同时5
’
端的待测靶标序列能够激活识别DNA纳米原件并通过链置换反应释放引物，进一步触发下一轮PER反应，如此重复循环扩增，可以获得待测靶标核酸的信号放大效应，利用可视化信号识别系统包括荧光信号或核酸试纸条层析显色等，以实现样品中的病毒核酸的可视化检测。
[0017]本专利技术的有益效果是：DNAzyme是通过利用体外分子进化技术筛选得到的一种人工合成的功能核酸分子，具有核酸酶活性、过氧化物酶活性等多种催化功能及高效性和高特异性。其中具有10
‑
23基序的DNAzyme是一种高效且广泛催化RNA切割反应的单链DNA分子，由15个高度保守的脱氧核糖核苷酸构成催化活性中心，两侧分别有由7
‑
8个脱氧核糖核苷酸构成底物结合臂，可通过Watson
‑
Crick碱基配对与RNA底物发生特异性结合。因此，本专利技术基于PER技术的联级扩增效应及其合成长单链DNA的特性，构建了一种新型、高扩增效率且检测信号放大的PER
‑
DNAzyme生物传感器，该技术灵敏度高、特异性好，成本低，常温条件下就能够用于样品中痕量病毒核酸的快速可视化检测。
[0018]引物交换反应(Primer Exchange Reaction，PER)是一种恒温核酸扩增方法，通过一个短的引物序列(与催化发夹的短悬垂结构序列互补)，在DNA置换酶的作用下，引物被拓展了一段催化发夹序列，随后被置换出去，而重获自由的催化发夹再进入下一轮级联进程，或是捕获新引物，或是捕获已被延长过的引物。通过一系列的延伸和置换反应，PER可恒温、可编本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于DNAzyme与PER扩增的病毒检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：可识别病毒靶标序列的DNA纳米器件；催化发夹；RNA报告分子；检测反应体系。2.根据权利要求1所述的基于DNAzyme与PER扩增的病毒检测试剂盒，其特征在于，所述RNA报告分子5
‘
端标记荧光报告基团FAM，3
’
端标记荧光淬灭基团BHQ1。3.根据权利要求1所述的基于DNAzyme与PER扩增的病毒检测试剂盒，其特征在于，所述检测反应体系包括镁离子、Bst链置换聚合酶、dNTPs、1
×
PBS缓冲液。4.根据权利要求1所述的基于DNAzyme与PER扩增的病毒检测试剂盒，其特征在于，所述可识别病毒靶标序列的DNA纳米器件由病毒特异性引物寡核苷酸序列（p）与其互补寡核苷酸序列（t*+p*）通过退火处理制备而成，其中t*作用在于提供一段用于启动链置换反应的支点链，碱基数量可为5bp至10bp其中之一，p*作用在于提供引物结合的一段互补寡核苷酸序列，碱基数量可为7bp至12bp其中之一。5.根据权利要求1所述的基于DNAzyme与PER扩增的病毒检测试剂盒，其特征在于，所述可识别病毒靶标序列的DNA纳米器件上含有一段被封闭的病毒特异性引物寡核苷酸序列（p），碱基数量可为7bp至12bp其中之一，待测病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴军华，邱海燕，高恶斌，卢燕波，胡雨润，
申请(专利权)人：宁波市妇女儿童医院，
类型：发明
国别省市：