一种在固体聚合物表面上基于苯硼酸和蛋白A共同偶联抗体的定向固定方法技术

本发明专利技术公开了一种在固体聚合物表面上基于苯硼酸和蛋白A共同偶联抗体的定向固定方法，依次在固体基片的表面形成亲水表面层、含有氨基的修饰层、苯硼酸分子层和蛋白A层。本发明专利技术将苯硼酸法与蛋白A法两种抗体固定方法结合起来，利用两种方法的选择性结合抗体Fc端的特性定向偶联抗体。由于苯硼酸与蛋白A尺度和臂长的差异性，在共同偶联抗体时可有效降低抗体分子间的空间位阻，也降低了抗体捕获抗原时抗原分子间的空间位阻，提高了抗体固载量以及抗体固定后的空间密度，提高免疫检测灵敏度。提高免疫检测灵敏度。提高免疫检测灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
一种在固体聚合物表面上基于苯硼酸和蛋白A共同偶联抗体的定向固定方法


[0001]本专利技术涉及免疫分析用芯片领域，特别是涉及一种在固体聚合物表面上基于苯硼酸和蛋白A共同偶联抗体的定向固定方法。

技术介绍

[0002]基于微流控芯片的免疫检测技术作为一种新型的及时检测技术在医学诊断、健康护理、环境监测及食品检测等方面的应用越来越广泛。其应用基础是在固相芯片上固定抗原或抗体而进行免疫检测，一般固定抗体更为广泛。抗体固定技术对免疫测定的稳定性和灵敏度的影响主要表现在抗体固载量和抗体的识别能力两个方面。理想的抗体固定技术是在保持抗体活性的基础上将抗体的Fc端连接在固相载体上，从而使具有抗原结合活性的Fab端定向朝向外侧。
[0003]目前固相载体抗体固定主要是通过基于亲和作用的物理吸附法、共价偶联法实现以及蛋白A等定向固定法。但是当前抗体固定方法面临以下问题：
[0004]基于亲和作用的非特异性吸附方法固定的抗体难以将Fab定向朝向外侧，降低了抗体捕获目标抗原的能力，且这种物理吸附稳定性差，容易出现抗体脱落和活性降低的问题。
[0005]共价偶联法能有效提高固相载体的抗体结合能力，这种结合主要由蛋白质分子的
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NH2、
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COOH、
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OH或
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SH等活性基团与固相载体表面活性基团产生共价偶联而完成的。由于上述活性基团在蛋白质分子上分布的不确定性和不唯一性，使得这种共价偶联具有较大的随机性。同时，共价偶联也会导致不可控的物理吸附现象。共价键的结合位置靠近抗原结合位点时会影响其活性。一些情况下需对抗体进行预处理，从而导致操作步骤的复杂化和抗体活性的降低，如二硫键的还原或强氧化剂的使用可能使抗体的免疫活性受到影响。
[0006]蛋白A法等，不涉及抗体的预处理，且具有优良的抗体定向固定效果。然而这类方法多是单一偶联的，由于距离固相表面的空间位置相近，增加了相互间的空间位阻，不利于抗体的高密度有效固定及后续抗原的高效捕获，难以满足痕量级甚至超痕量级分子的高灵敏度检测需求。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种在固体聚合物表面上基于苯硼酸和蛋白A共同偶联抗体的定向固定方法，该方法先对聚合物芯片表面进行亲水和氨基化处理，然后依次偶联苯硼酸层和蛋白A层，二者可分别在不同空间上偶联抗体Fc端，实现抗体与聚合物芯片表面的高效定向偶联。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0009]一种在固体聚合物表面上基于苯硼酸和蛋白A共同偶联抗体的定向固定方法，其特征在于：包括以下步骤：
[0010]S1、选用固体聚合物为原料，并对其通过常规加工方法制作所需固体基片的结构，对固体基片进行表面清洁和表面亲水处理，在固体基片的表面形成亲水表面层；优选的，所述表面亲水处理的方法为采用等离子处理。
[0011]S2、将经过步骤S1处理后的固体基片浸入到聚乙烯亚胺(PEI)溶液中，PEI溶液的配比、浸泡时间、温度依据情况而定，在固体基片的表面得到含有氨基的修饰层；
[0012]S3、将表面含有氨基修饰层的固体基片浸入到4
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甲酰基苯硼酸的乙醇溶液中，溶液的配比、浸泡时间、温度依据情况而定。随后经过清洗和干燥，在固体基片的表面得到苯硼酸分子层；
[0013]S4、将表面含有苯硼酸分子层的固体基片浸入到戊二醛溶液中，将剩余氨基修饰为醛基，溶液的配比、浸泡时间、温度依据情况而定。随后用氰基硼氢化钠和水清洗，并干燥；
[0014]S5、将链霉亲和素和生物素化蛋白A混合后获得蛋白A复合物，溶液的配比、震荡时间、温度依据情况而定。然后将蛋白A复合物滴定在经过步骤S4处理后的固体基片上所预设的区域内，用PBS缓冲液清洗并干燥后，在固体基片的表面得到所需的蛋白A层；
[0015]S6、将抗体滴定在经过上述步骤S5处理后的固体基片上所预设的区域内，溶液的配比、浸泡时间、温度依据情况而定。用PBS缓冲液清洗并干燥后，在固体基片的表面得到定向固定的抗体层。
[0016]优选的方案，所述的固体聚合物为固体有机材料或固体复合材料；进一步优选为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，PMMA是生物亲和性好的固相聚合物之一，成本低廉，易于加工和大规模生产。
[0017]优选的方案，所述亲水表面层、苯硼酸分子层、蛋白A层均为单分子层。
[0018]优选的方案，所述抗体包括各种用于免疫检测的抗体分子。
[0019]与已有方法相比，本专利技术的有益效果为：
[0020]1)生物素
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链酶亲和素系统的引入将多个蛋白A分子连接成蛋白A分子团，一个醛基可偶联多个蛋白A分子，相对于传统的一个醛基偶联单个蛋白A分子，本专利技术提高了蛋白A在基底上的表面密度，从而提升抗体载量和检测灵敏性。
[0021]2)由于蛋白A和苯硼酸尺寸和臂长的差异，共同偶联的方式可以减少抗体间的空间位阻，提高抗体固定数量。并且，固定的抗体距离固相基底的距离不同，抗体呈交错分布。这种分布又可以减小抗体在捕获抗原时的空间位阻。进一步提升了捕获效率和检测灵敏度，有利于实现低丰度蛋白质免疫分析的高性能免疫检测。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0023]图1为实施例中含有苯硼酸和蛋白A表面修饰层的芯片制备及其定向固定抗体示意图。
[0024]图2为基于本专利技术实施例与基于蛋白A法的对比例1、苯硼酸法的对比例2所偶联抗
体的PMMA芯片荧光免疫检测结果对比图。
具体实施方式
[0025]下面结合附图和实施例对本专利技术作更进一步的说明。
[0026]实施例
[0027]S1、将PMMA固体基片依次用超声波和等离子体清洗。
[0028]S2、将PMMA固体基片在常温下浸泡于PH11.5，0.2％ PEI溶液1h，用去离子水清洗并干燥，在PMMA固体基片的表面得到含有氨基的修饰层。
[0029]S3、用15mg/mL的4
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甲酰基苯硼酸的乙醇溶液常温下处理步骤S2中的PMMA固体基片24h，用去离子水清洗并干燥，在PMMA固体基片的表面得到苯硼酸分子层。
[0030]S4、将经过步骤S3处理后的PMMA固体基片浸入到10％戊二醛溶液中，常温处理1h。随后用氰基硼氢化钠和去离子水清洗，并干燥。
[0031]S5、然后将蛋白A复合物溶液滴定在PMMA固体基片上所预设的区域内，在4℃过夜处理(蛋白A复合物溶液由体积比为1：1的150μg/mL链霉亲和素的PBS溶液和280μg/mL生物素化蛋白A的PBS溶液在37℃环境震荡1h获得)。用PBS缓冲液清本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在固体聚合物表面上基于苯硼酸和蛋白A共同偶联抗体的定向固定方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、选用固体聚合物作为固体基片，并对其进行表面清洁和表面亲水处理，在固体基片的表面形成亲水表面层；S2、将经过步骤S1处理后的固体基片浸入到聚乙烯亚胺溶液中，在固体基片的表面得到含有氨基的修饰层；S3、将表面含有氨基修饰层的固体基片浸入到4
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甲酰基苯硼酸溶液中，在固体基片的表面得到苯硼酸分子层；S4、将表面含有苯硼酸分子层的固体基片浸入到戊二醛溶液中，随后用氰基硼氢化钠和水清洗，并干燥；S5、将链霉亲和素和生物素化蛋白A混合后获得蛋白A复合物，然后将蛋白A复合物滴定在经过步骤S4处理后的固体基片上所预设的区域内，经过清洗、干燥后，在固体基片的表面得到所需的蛋白A层；S6、将抗体滴定在经过上述步骤S5处理后的固体基片上所预设的区域内，经过清洗、干燥后，在固体基片的表面得到定向固定的抗体层。2.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：尤晖，代鹏，孙翠敏，韩伟，常建国，苏文云，
申请(专利权)人：孙翠敏，
类型：发明
国别省市：