【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于测定表达嵌合抗原的免疫细胞的体外肿瘤杀伤活性的基于细胞的测定法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年6月8日提交的美国临时申请序列号63/036,249和2020年12月14日提交的美国临时申请序列号63/125,173的权益。上述申请的全部内容全文以引用方式并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请包含已经以ASCII格式电子递交的序列表,并且据此全文以引用方式并入。所述ASCII副本创建于2021年6月4日,命名为JBI6329WOPCT1_SL.txt,并且大小为28,710字节。
[0005]本专利技术提供了用于测定表达嵌合抗原受体的免疫细胞的效力(例如,细胞毒性)的改进的测定法。这些改进的测定法允许避免使用模拟转染的免疫细胞作为测定对照,而是使用防止免疫细胞的嵌合抗原受体与其靶细胞相互作用的抑制性分子作为测定对照。
技术介绍
[0006]目前测定表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR
‑
T细胞)的特异性体外细胞毒性的方法涉及使用自体未转导扩增T细胞(模拟细胞)作为基线对照。这些对照用于计算转导的CAR
‑
T细胞的特异性细胞毒性。然而,产生未转导扩增的自体或同种异体对照T细胞(模拟细胞)既昂贵又耗时,特别是因为这些细胞通常由患者自身的T细胞产生。此外,这些模拟细胞的生产容易无法达到需要的产量,这可能延迟治疗或妨碍免疫治疗期间CAR
‑
T细胞的适当给药。
[0007]测定CAR >‑
T细胞的体外细胞毒性的方法涉及使用自体未转导扩增T细胞(模拟细胞)作为基线对照。基线对照用于计算CAR
‑
T细胞特异性细胞毒性的增加百分比(CAR
‑
T杀伤%)。如果没有自体模拟细胞可用,则改为使用合格批次的过敏原模拟细胞。然而,使用这些合格批次引起了相对于同种异体模拟细胞的效力,因而可能无法反映CAR
‑
T细胞的真实效力。替代性地,省去该基线对照,使用总细胞毒活性。然而,总细胞毒活性并没有指出免疫细胞/靶细胞相互作用的细胞毒活性是否已经由于CAR
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T细胞而出现任何增强。总细胞毒活性不能区分药物产品的贡献和靶细胞本身的自发死亡。替代性测定法(诸如细胞因子ELISA)已经用于代替功能测定法作为测量活性的替代方案,但是这些方法不能直接测量细胞毒性。
[0008]因此,需要改进的测定对照,以便简化CAR
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T细胞的生产和测试,同时保持CAR
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T细胞效力的准确性,并且同时降低与使用模拟细胞和/或当模拟细胞不可用时的附加替代性测定法相关联的高成本和高复杂性。本申请通篇描述的主题通过提供不需要使用模拟细胞作为对照的新型测定法来满足该需求。
技术实现思路
[0009]在一个方面,提供了一种用于测定表达嵌合抗原受体(CAR)分子的免疫细胞的效力的体外方法,该方法包括:
[0010]a)在测试样品中,使表达CAR的免疫细胞与靶细胞接触,其中靶细胞表达与CAR相互作用的抗原,
[0011]b)在第一对照样品中,使表达CAR的免疫细胞与靶细胞接触,其中(i)所述接触在抑制性分子的存在下进行,或者(ii)在所述接触之前,表达CAR的免疫细胞和/或靶细胞已经与抑制性分子一起预孵育,其中抑制性分子抑制CAR与靶细胞之间的相互作用,
[0012]c)测定测试样品中的靶细胞死亡量,
[0013]d)测定第一对照样品中的靶细胞死亡量,以及
[0014]e)基于比较在步骤(c)和(d)中测定的靶细胞死亡量来确定表达CAR的免疫细胞的效力,
[0015]其中在测试样品和第一对照样品中,接触时间、表达CAR的免疫细胞的量和靶细胞的量基本上相同。
[0016]在一些实施方案中,接触步骤(a)和(b)同时进行。在一些实施方案中,测定步骤(c)和(d)同时进行。
[0017]在一些实施方案中,在步骤(b)(i)中,表达CAR的免疫细胞和/或靶细胞在接触步骤之前已经与抑制性分子一起预孵育。
[0018]在一些实施方案中,该方法还包括将步骤(c)中测定的靶细胞死亡量与第二对照样品中测定的靶细胞死亡量进行比较,其中靶细胞在不存在表达CAR的免疫细胞的情况下孵育。
[0019]在一些实施方案中,该方法还包括将步骤(c)中测定的靶细胞死亡量与第三对照样品中测定的靶细胞死亡量进行比较,其中靶细胞在不存在表达CAR的免疫细胞但存在引起靶细胞死亡的洗涤剂的情况下孵育。在某些实施方案中,洗涤剂是Triton X
‑
100。
[0020]在各种实施方案中,靶细胞在所述靶细胞死亡时产生可检测的报告信号,并且步骤(c)包括测定测试样品中的报告信号,步骤(d)包括测定第一对照样品中的报告信号,并且步骤(e)包括比较在步骤(c)和(d)中测定的报告信号。
[0021]在一些实施方案中,报告信号是发光。在一些实施方案中,报告信号是荧光。在一些实施方案中,靶细胞表达在靶细胞经历细胞死亡时产生信号的报告蛋白。在一些实施方案中,报告蛋白是β
‑
半乳糖苷酶、荧光素酶或绿色荧光蛋白(GFP),或者它们的变体或衍生物。在一些实施方案中,抑制性分子特异性地结合靶细胞上与CAR相互作用的抗原。
[0022]在一些实施方案中,抑制性分子特异性地结合CAR。在一些实施方案中,抑制性分子特异性地结合CAR内特异性地结合靶细胞上表达的抗原的区域。在一些实施方案中,抑制性分子是抗体或抗体片段。在某些实施方案中,该抗体是抗独特型抗体。在一些实施方案中,该抗体片段是Fab、Fab
′
、F(ab
′
)2、Fv或Fd片段、单链抗体(scFv)、线性抗体、单结构域抗体、重链可变区(VH)结构域或轻链可变区(VL)结构域。在一些实施方案中,该抗体或抗体片段特异性地结合CAR的scFv结构域内的抗原。在一些实施方案中,该抗体或抗体片段特异性地结合CAR的scFv结构域内的CDR。在一些实施方案中,该抗体或抗体片段特异性地结合CAR的VH结构域或VL结构域内的抗原。在一些实施方案中,该抗体或抗体片段特异性地结合CAR
的VH结构域或VL结构域内的CDR。在一些实施方案中,抑制性分子是靶细胞上表达的与CAR相互作用的抗原的可溶形式,或者其功能性片段或衍生物。
[0023]在一些实施方案中,免疫细胞选自T细胞、诱导多能干细胞(iPSC)和自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中,CAR与B细胞成熟抗原(BCMA)受体相互作用,靶细胞包含BCMA受体,并且抑制性分子是BCMA的可溶性细胞质结构域。在一些实施方案中,靶细胞是多发性骨髓瘤细胞。在某些实施方案中,多发性骨髓瘤细胞是MM
‑
1R细胞。
[0024]在一些实施方案中,CAR与G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)相互作用,靶细胞包含GPRC本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于测定表达嵌合抗原受体(CAR)分子的免疫细胞的效力的体外方法,所述方法包括:a)在测试样品中,使所述表达CAR的免疫细胞与靶细胞接触,其中所述靶细胞表达与所述CAR相互作用的抗原,b)在第一对照样品中,使所述表达CAR的免疫细胞与所述靶细胞接触,其中(i)所述接触在抑制性分子的存在下进行,或者(ii)在所述接触之前,所述表达CAR的免疫细胞和/或所述靶细胞已经与所述抑制性分子一起预孵育,其中所述抑制性分子抑制所述CAR与所述靶细胞之间的相互作用,c)测定所述测试样品中的靶细胞死亡量,d)测定所述第一对照样品中的靶细胞死亡量,以及e)基于比较在步骤(c)和(d)中测定的所述靶细胞死亡量来确定表达CAR的免疫细胞的效力,其中在所述测试样品和所述第一对照样品中,所述接触时间、所述表达CAR的免疫细胞的量和所述靶细胞的量基本上相同。2.根据权利要求1所述的方法,其中所述接触步骤(a)和(b)同时进行。3.根据权利要求1所述的方法,其中所述测定步骤(c)和(d)同时进行。4.根据权利要求1所述的方法,其中在步骤(b)(i)中,所述表达CAR的免疫细胞和/或所述靶细胞在所述接触步骤之前已经与所述抑制性分子一起预孵育。5.根据权利要求1所述的方法,其中所述方法还包括将步骤(c)中测定的所述靶细胞死亡量与第二对照样品中测定的所述靶细胞死亡量进行比较,其中所述靶细胞在不存在所述表达CAR的免疫细胞的情况下孵育。6.根据权利要求1所述的方法,其中所述方法还包括将步骤(c)中测定的所述靶细胞死亡量与第三对照样品中测定的所述靶细胞死亡量进行比较,其中所述靶细胞在不存在所述表达CAR的免疫细胞但存在引起所述靶细胞死亡的洗涤剂的情况下孵育。7.根据权利要求6所述的方法,其中所述洗涤剂是Triton X
‑
100。8.根据权利要求1所述的方法,其中所述靶细胞在所述靶细胞死亡时产生可检测的报告信号,并且步骤(c)包括测定所述测试样品中的所述报告信号,步骤(d)包括测定所述第一对照样品中的所述报告信号,并且步骤(e)包括比较在步骤(c)和(d)中测定的所述报告信号。9.根据权利要求8所述的方法,其中所述报告信号是发光。10.根据权利要求8所述的方法,其中所述报告信号是荧光。11.根据权利要求8所述的方法,其中所述靶细胞表达在所述靶细胞经历细胞死亡时产生信号的报告蛋白。12.根据权利要求11所述的方法,其中所述报告蛋白是β
‑
半乳糖苷酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP),或者它们的变体或衍生物。13.根据权利要求1所述的方法,其中所述抑制性分子特异性地结合所述靶细胞上与所述CAR相互作用的所述抗原。14.根据权利要求1所述的方法,其中所述抑制性分子特异性地结合所述CAR。15.根据权利要求14所述的方法,其中所述抑制性分子特异性地结合所述CAR内特异性
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