一种基于聚集诱导发光检测痰结核杆菌的方法技术

本发明专利技术涉及病原菌检测技术领域，具体涉及一种基于聚集诱导发光检测痰结核杆菌的方法，包括步骤a、取肺结核病人的待测痰液标本；步骤b、配制胰酶消化液；步骤c、向加入等量混匀的胰酶消化液，静置30分钟至充分液化无痰丝，将混合液转移到Eppendorf管中，离心弃上清液，得到沉淀；步骤d、沉淀中加PBS溶液，振荡洗涤后离心，重复洗涤2次，弃上清液；步骤e、AIE染料荧光染色，涂片后用奥林巴斯BX41荧光显微镜观察。本发明专利技术的检测方法能够快速准确地识别不同种类的病原菌，从而将结核杆菌检测出来，而且操作简单、稳定性好、灵敏度高，为肺结核的临床诊断提供有效的技术手段。断提供有效的技术手段。断提供有效的技术手段。

【技术实现步骤摘要】
一种基于聚集诱导发光检测痰结核杆菌的方法


[0001]本专利技术涉及病原菌检测
，具体涉及一种基于聚集诱导发光检测痰结核杆菌的方法。

技术介绍

[0002]传统的有机发光材料在聚集状态下，荧光通常会减弱或淬灭，即在聚集状态(高浓度溶液或者固态)下，分子间紧密的π－π堆积形成激基缔合物，导致非辐射能量转换、荧光变弱甚至完全消失，这一现象即为聚集导致荧光淬灭(简称ACQ)其严重制约了有机发光材料的实际应用。随着科技的发展，香港科技大学唐本忠教授课题组发现六苯基噻咯(HPS)在乙腈溶液中几乎不发光，但加入不良溶剂使HPS溶解度下降，聚集析出的过程中，荧光却显著增强，这一现象与传统的ACQ现象恰好相反，他们将其命名为聚集诱导发光(简称AIE)现象。AIE现象的发现为有机光功能材料的应用研究打开了窗户，经过近十几年的发展，AIE已成为聚集时具有发光性质的材料的代名词，具有聚集诱导发光(AIE)性质的化合物在聚集状态下，通过分子内部的自我调节实现荧光增强，弥补传统发光材料在该方面的不足，在荧光传感、电致发光、固体激光与生物成像等领域展现出广阔的应用前景。
[0003]病原菌感染严重威胁人类生命健康，为确保有效治疗，快速可靠的病原菌鉴定是第一步。但是传统的鉴定方法较为复杂，耗时较长。现有技术中，荧光探针具有响应迅速，灵敏度高，操作简单等优点，已广泛用于病原菌鉴定。但是传统的荧光探针往往存在聚集诱导猝灭(ACQ)和稳定性差的问题，大大降低了检测的灵敏度。因此，迫切需要一种快速可靠的方法来识别各种病原菌。
专利技术内容
[0004]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，而提供一种基于聚集诱导发光检测痰结核杆菌的方法，该方法能够快速准确地识别不同种类的病原菌，从而将结核杆菌识别出来，而且操作简单、稳定性好。
[0005]本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
[0006]提供一种基于聚集诱导发光检测痰结核杆菌的方法，包括以下步骤：
[0007]步骤a、取肺结核病人的待测痰液标本，涂片镜检合格后备用；
[0008]步骤b、配制胰酶消化液；
[0009]步骤c、向待测痰液标本中加入等量混匀的胰酶消化液，搅动痰液使充分混匀，静置30分钟至充分液化无痰丝，将混合液转移到Eppendorf管中，离心，弃上清液，得到沉淀；
[0010]步骤d、向步骤c的沉淀中加PBS溶液5mL，振荡洗涤后离心，如此重复洗涤2次，弃上清液，沉淀用作结核杆菌荧光染色用；
[0011]步骤e、AIE染料荧光染色：取步骤d的沉淀，加入500ul PBS混匀重悬，加入5ul C6
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BD荧光染料混匀，室温染色，涂片后用奥林巴斯BX41荧光显微镜观察。
[0012]上述技术方案中，步骤b中，称取5g胰酶溶于100mL含50mmoLCaCl2的PBS溶液中，用
质量浓度为2％的NaOH溶液调pH至8.0，混匀后于4℃保存。
[0013]上述技术方案中，步骤c中，离心转速为10000r/min，时间为5分钟。
[0014]上述技术方案中，步骤d中，离心转速为10000r/min，时间为5分钟。
[0015]上述技术方案中，步骤e中，染色时间为20分钟。
[0016]本专利技术的有益效果：
[0017]本专利技术的一种基于聚集诱导发光检测痰结核杆菌的方法，包括步骤a、取肺结核病人的待测痰液标本，涂片镜检合格后备用；步骤b、配制胰酶消化液；步骤c、向待测痰液标本中加入等量混匀的胰酶消化液，搅动痰液使充分混匀，静置30分钟至充分液化无痰丝，将混合液转移到Eppendorf管中，离心，弃上清液，得到沉淀；步骤d、向步骤c的沉淀中加PBS溶液5mL，振荡洗涤后离心，如此重复洗涤2次，弃上清液，沉淀用作结核杆菌荧光染色用；步骤e、AIE染料荧光染色：取步骤d的沉淀，加入500ul PBS混匀重悬，加入5ul C6
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BD荧光染料混匀，室温染色20分钟，涂片后用奥林巴斯BX41荧光显微镜观察。采用上述方法，C6
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BD荧光染料所含的聚集诱导发光基团以代谢标记的方式大量聚集至结核杆菌细胞壁，通过荧光显微成像，该聚集诱导发光基团在光照辐射下因聚集产生荧光信号，从而将结核杆菌识别出来。本专利技术的检测方法能够快速准确地识别不同种类的病原菌，从而将结核杆菌检测出来，而且操作简单、稳定性好、灵敏度高，为肺结核的临床诊断提供有效的技术手段。
附图说明
[0018]利用附图对本专利技术作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本专利技术的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
[0019]图1为本专利技术实施例1的在荧光显微镜和普通显微镜下的观察结果。
具体实施方式
[0020]结合以下实施例对本专利技术作进一步描述。
[0021]本实施例的一种基于聚集诱导发光检测痰结核杆菌的方法的制备方法如下：
[0022]步骤a、取肺结核病人的待测痰液标本，涂片镜检合格后备用；
[0023]本实施例中的待测痰液标本均来自东莞明志医学检验所，要求病人晨起后漱口，深咳出，然后咳痰入样本盒，加盖送检，样本应避免混入唾沫；涂片镜检应有大量上皮细胞及尘细胞，否则重留。
[0024]步骤b、采用胰酶消化法对痰液标本进行处理，用于痰液结核杆菌的提纯：
[0025]称取5g胰酶溶于100mL含50mmoLCaCl2的PBS溶液中，用质量浓度为2％的NaOH溶液调pH至8.0，混匀后于4℃保存；
[0026]该胰酶购自SIGMA公司。
[0027]步骤c、向待测痰液标本中加入等量混匀的胰酶消化液，搅动痰液使充分混匀，静置30分钟至充分液化无痰丝，将混合液转移到Eppendorf管中，10000r/min离心5分钟，弃上清液，得到沉淀。
[0028]步骤d、向步骤c的沉淀中加PBS溶液5mL，振荡洗涤后离心，10000r/min离心5分钟；如此重复洗涤2次，弃上清液，沉淀用作结核杆菌荧光染色用。
[0029]步骤e、AIE染料荧光染色：取步骤d的沉淀，加入500ul PBS混匀重悬，加入5ul C6
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BD荧光染料混匀，室温染色20分钟，涂片后用奥林巴斯BX41荧光显微镜观察，结果如图1c和图1d所示。图1a和图1b是普通显微镜下的观察结果。图中的方框内为结核杆菌。
[0030]由图1可知，采用C6
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BD荧光染料染色后，在奥林巴斯BX41荧光显微镜下能够清晰地看到绿色荧光标记的结核杆菌和目标结核杆菌，而普通显微镜下无法识别。
[0031]本专利技术的检测方法能够快速准确地识别不同种类的病原菌，从而将结核杆菌检测出来，而且操作简单、稳定性好、灵敏度高，为肺结核的临床诊断提供有效的技术手段。
[0032]最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本专利技术的技术方案，而非对本专利技术保护范围的限制，尽管参照较本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于聚集诱导发光检测痰结核杆菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤a、取肺结核病人的待测痰液标本，涂片镜检合格后备用；步骤b、配制胰酶消化液；步骤c、向待测痰液标本中加入等量混匀的胰酶消化液，搅动痰液使充分混匀，静置30分钟至充分液化无痰丝，将混合液转移到Eppendorf管中，离心，弃上清液，得到沉淀；步骤d、向步骤c的沉淀中加PBS溶液5mL，振荡洗涤后离心，如此重复洗涤2次，弃上清液，沉淀用作结核杆菌荧光染色用；步骤e、AIE染料荧光染色：取步骤d的沉淀，加入500ul PBS混匀重悬，加入5ul C6
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BD荧光染料混匀，室温染色，涂片后用奥林巴斯BX41荧光显微...

【专利技术属性】
技术研发人员：付文金，谢岭平，赖丽莎，彭兰芬，邓任堂，张露，
申请(专利权)人：东莞市厚街医院，
类型：发明
国别省市：