一种原奶中活菌总数的快检方法技术

本发明专利技术公开了一种原奶中活菌总数的快检方法，具体涉及食品微生物检测领域。所述方法包括使用第一处理液与第二处理液完成原奶样品预处理，得预处理样品；使用核酸染料对预处理样品进行第一荧光标记，并使用死菌特异性染料对预处理样品同时进行第二荧光标记，得到标记样品；使用高分辨率流式细胞仪对标记样品中颗粒的荧光信号进行检测；分别统计所述样品中第一荧光标记颗粒数与第二荧光标记颗粒数，依据数学模型将颗粒数转化为活菌总数。本发明专利技术的原奶中活菌总数的快检方法可以对细菌活性进行准确的表达，且可以同时表达出活菌和死菌的数量；具有细菌活性表征准确、测量时间短的特征，可在2小时内完成全部检测。可在2小时内完成全部检测。可在2小时内完成全部检测。

【技术实现步骤摘要】
一种原奶中活菌总数的快检方法


[0001]本专利技术涉及食品微生物检测领域，具体涉及一种原奶中活菌总数的快检方法。

技术介绍

[0002]食品微生物污染是影响食品安全的重要问题，其中活菌总数是最受关注的因素之一。原奶营养丰富，生产过程中极易受到微生物污染，从而导致乳品腐败，产生潜在的食品安全问题。对乳制品质量的管控，贯穿于从牧场到消费者的整个过程。在此过程中，原奶质量至关重要，并被密切监测。按照规定，A级原奶的标准平板菌落计数法(SPC)的数值不能超过10万，体细胞数(SCC)不能超过75万。此外，原奶也必须满足其他质量标准要求，如无药物残留、不能注水，以及不能有沉淀、脏污或其他杂质。在例行检测中，牧场的整体情况和清洁程度也需要检测。尽管原奶质量已有了明确的法定标准，但绝大部分行业人士都认为，采用更严格的标准可以带来更优质的奶源，并且采购商对远超过法定质量标准的原奶，也愿意多付钱。
[0003]目前，牛奶中活菌总数主要参考《GB4789.2
‑
2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中的平板计数法检测，但是该方法需培养72h后计数得到结果，耗时长、步骤繁琐，难以满足实际需求。因此，有必要建立原奶中活菌总数的快速准确检测方法。
[0004]目前常见的活菌总数快速检测方法包括即用型纸片法、ATP法、刃天青法等。然而，上述方法仍存在无法绝对定量、数据不稳定、测量周期长、易受杂质干扰等问题。为克服上述问题，流式分析法越来越广泛地应用于细菌测量与分析。通过高效标记活死细菌，即可利用流式细胞仪准确快速地计数样品中的活细菌数。目前常用的活死菌标记多以膜完整性、胞内酶活性和细胞呼吸活性为靶标，通过选取对应的荧光染料，实现样品中活菌标记与流式分析。但是，膜完整性、胞内酶活性和细胞呼吸活性等参数是否准确代表细菌的真实活性是未知的；例如，紫外消毒后，细菌虽然死亡，但膜结构仍然完整；部分细菌死亡后，仍可能表现出胞内酶活性；休眠细菌呼吸活性普遍较弱，相关染料可能无法准确表征等。此外，流式分析法与平板计数法得到的活菌总数结果并非完全一致，相关差异与样品中细胞活性显著相关，并且两者的换算关系是未知的。因此，为实现样品中活菌总数的快速准确测量，亟需发掘准确表征活菌的细胞活性参数及对应染料，并建立可靠的流式分析结果与平板计数结果间的数学模型。

技术实现思路

[0005]为此，本专利技术提供一种原奶中活菌总数的快检方法，以解决现有检测方法耗时长、不能同时准确检测活死菌、检测方法复杂等问题。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]根据本专利技术提供的一种原奶中活菌总数的快检方法，包括：
[0008]步骤一，使用第一处理液与第二处理液完成原奶样品预处理，得预处理样品；
[0009]步骤二，使用核酸染料对预处理样品进行第一荧光标记，并使用死菌特异性染料
对预处理样品同时进行第二荧光标记，得到标记样品；
[0010]步骤三，使用高分辨率流式细胞仪对标记样品中颗粒的荧光信号进行检测；
[0011]步骤四，分别统计所述样品中第一荧光标记颗粒数与第二荧光标记颗粒数，依据数学模型将颗粒数转化为活菌总数；
[0012]其中，第一处理液包含可去除原奶样品中脂质颗粒的温和去垢剂；第二处理液包含可消化原奶样品中蛋白颗粒的蛋白酶混合物。
[0013]进一步的，所述步骤二中，通过开展原奶代表物种在牧场典型消毒胁迫条件下的活性表征研究，发掘筛选得到可准确表征代表物种活性的死菌特异性染料。
[0014]进一步的，所述步骤二中，核酸染料为膜通透性红色荧光核酸染料；
[0015]和/或，所述死菌特异性染料为可准确表征细胞活性的绿色荧光染料；该染料特异性进入无膜电势差的死菌细胞内部，与蛋白组分结合发出绿色荧光信号。
[0016]进一步的，所述膜通透性红色荧光核酸染料选自SYTO17，SYTO59，SYTO60，SYTO61，SYTO62，SYTO63，SYTO64中的一种或几种。
[0017]进一步的，所述死菌特异性绿色荧光染料选自双(1,3
‑
二巴比妥酸)类荧光染料。
[0018]进一步的，所述步骤二中，第一荧光标记条件为核酸染料浓度1
‑
100μM，室温避光孵育10
‑
60min；
[0019]和/或，第二荧光标记条件为死菌特异性染料浓度1
‑
50μM，室温避光孵育10
‑
60min。
[0020]进一步的，所述步骤三中，高分辨率流式细胞仪光学分辨率为30
‑
100nm，所述高分辨率流式细胞术通过透镜系统将收集到的光信号进行光电转换，分别拾取样品中各个细菌发射的光电信号；检测电压为300
‑
500V，进样体积为10
‑
1000μL，分析时间为10
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100s。
[0021]进一步的，所述高分辨率流式细胞仪中，第一荧光标记波长为599
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690nm，红色荧光；第二荧光标记波长为499
‑
540nm，绿色荧光。
[0022]进一步的，所述步骤四中，数学模型为
[0023][0024]其中，N为推导计算的平板计数法结果(CFU/mL)，A为红色荧光单独表征的活菌数目(cells/μL)，B为红色和绿色荧光共同表征的死菌数目(cells/μL)，3为换算系数。
[0025]进一步的，所述步骤四中，第一荧光标记颗粒数、第二荧光标记颗粒数与活菌总数的数学模型为对数关系，相关系数R2大于0.97。
[0026]本专利技术具有如下优点：
[0027](1)本专利技术的原奶中活菌总数的快检方法具有预处理方法简单、杂质消解彻底、检测灵敏度高的特征；
[0028](2)本专利技术的原奶中活菌总数的快检方法可以对细菌活性进行准确的表达，且可以同时表达出活菌和死菌的数量；具有细菌活性表征准确、测量时间短的特征，可在2小时内完成全部检测；
[0029](3)本专利技术的原奶中活菌总数的快检方法可通过建立的数学模型，将流式分析结果准确可靠转换至平板计数法结果，方便与现有标准比较，显著提升原奶中活菌总数检测的效率。
附图说明
[0030]为了更清楚地说明本专利技术的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引申获得其它的实施附图。
[0031]本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本专利技术可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本专利技术所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本专利技术所揭示本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种原奶中活菌总数的快检方法，其特征在于，包括：步骤一，使用第一处理液与第二处理液完成原奶样品预处理，得预处理样品；步骤二，使用核酸染料对预处理样品进行第一荧光标记，并使用死菌特异性染料对预处理样品同时进行第二荧光标记，得到标记样品；步骤三，使用高分辨率流式细胞仪对标记样品中颗粒的荧光信号进行检测；步骤四，分别统计所述样品中第一荧光标记颗粒数与第二荧光标记颗粒数，依据数学模型将颗粒数转化为活菌总数；其中，第一处理液包含可去除原奶样品中脂质颗粒的温和去垢剂；第二处理液包含可消化原奶样品中蛋白颗粒的蛋白酶混合物。2.根据权利要求1所述一种原奶中活菌总数的快检方法，其特征在于，所述步骤二中，核酸染料为膜通透性红色荧光核酸染料；和/或，所述死菌特异性染料为绿色荧光染料。3.根据权利要求2所述一种原奶中活菌总数的快检方法，其特征在于，所述膜通透性红色荧光核酸染料选自SYTO17，SYTO59，SYTO60，SYTO61，SYTO62，SYTO63，SYTO64中的一种或几种。4.根据权利要求2所述一种原奶中活菌总数的快检方法，其特征在于，所述死菌特异性绿色荧光染料选自双(1,3
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二巴比妥酸)类荧光染料。5.根据权利要求1所述一种原奶中活菌总数的快检方法，其特征在于，所述步骤二中，第一荧光标记条件为核酸染料浓度1
‑
100μM，室温避光孵...

【专利技术属性】
技术研发人员：隋志伟，王蒙，刘思渊，江游，龚晓云，
申请(专利权)人：中国计量科学研究院，
类型：发明
国别省市：