一种应用于青蟹苗种呼肠孤病毒检测的qRT-PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及水产病原检测领域，具体是一种应用于青蟹苗种呼肠孤病毒检测的qRT

【技术实现步骤摘要】
一种应用于青蟹苗种呼肠孤病毒检测的qRT
‑
PCR试剂盒


[0001]本专利技术涉及水产动物病原检测与病害防控
，具体地说，是一种应用于拟穴青蟹苗种呼肠孤病毒检测的qRT
‑
PCR试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]早期研究显示，青蟹呼肠孤病毒(Mud Crab Reovirus，MCRV)感染可导致青蟹近100％的死亡率。近年来的研究显示，该病毒感染非常普遍，几乎所有青蟹养殖池塘都可以检测到该病毒，给青蟹健康养殖造成巨大威胁。
[0003]研究发现，MCRV可以通过多种方式感染青蟹幼体，造成苗种带毒。因此，在青蟹苗种阶段进行病原检测，是切断MCRV传播的关键位点。在青蟹繁育过程中，从受精卵孵化到仔蟹需要经历等多个发育阶段，而了解受精卵和孵化幼体携带MCRV状况，能为健康苗种生产提供可靠保障。前期研究发现，受精卵及其蚤状幼体感染MCRV后，病毒含量通常较低，需利用高灵敏诊断技术检测，才能避免假阴性检测结果出现。因此，开发高灵敏MCRV检测方法是获取健康苗种的前提条件。
[0004]TaqMan探针荧光定量PCR是目前普遍采用的高灵敏性病原检测技术之一。与SYBR Green荧光定量PCR相比，其背景信号更低，灵敏性更强。而新型TaqMan
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MGB探针使该技术信噪比进一步提升，实验结果更精确，分辨率更高，是当前最灵敏的荧光定量PCR技术之一。

技术实现思路

[0005]本专利技术发现MCRV的不同基因的表达水平差异显著，VP11是病毒表达量最高的基因。本专利技术的目的在于进一步基于高表达的VP11序列设计PCR引物和荧光MGB探针，建立更高灵敏性的MCRV检测方法，满足青蟹苗种MCRV 检测的需要。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]本专利技术创制了一种高灵敏TaqMan探针qRT
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PCR检测试剂盒，用于青蟹苗种微量病原检测。前期研究发现，青蟹苗种甚至受精卵都存在MCRV感染现象，考虑到受精卵和幼体携带病毒量通常非常低，因此有必要开发高度灵敏的检测技术。在当前常规荧光定量PCR检测方法中，TaqMan MGB探针法虽然缺少溶解曲线分析程序，但其灵敏性最高。为此，本专利技术在MCRV高表达基因VP11序列的基础上，于其保守区设计了特异引物和特异探针，以此建立了一种TaqMan MGB探针qRT
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PCR检测试剂盒及方法。该MCRV检测方法灵敏性高，可精准定量10拷贝/反应，定性检测下限为2.5拷贝/反应。此外该检测方法特异性强，与5种常见甲壳动物病原(MCDV、WSSV、DIV1、EHP及弧菌)核酸样品均无特异性扩增。使用该检测方法，对不同时期蚤状幼体进行检测，均实现有效检测。上述结果表明该方法可以应用于青蟹幼体的MCRV感染状况调查。
[0008]本专利技术试剂盒能特异性检测MCRV，而不与甲壳动物常见病原发生交叉反应。本专利技术中，对青蟹和甲壳动物中最常见的几种病原(如MCDV、WSSV、 DIV1、EHP及副溶血弧菌)的核酸样品进行检测，均未出现交叉反应，表明该检测方法特异性强，可用于MCRV的特异性检
测。
[0009]本专利技术试剂盒灵敏性高于目前常见的MCRV检测方法。具体原因有2点。首先，该TaqMan MGB探针qRT
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PCR检测方法定量检测的灵敏性为10拷贝/ 反应，定性检测的下限为2.5拷贝/反应，这种检测能力已达TaqMan探针荧光定量检测方法检测能力的上限。其次，该检测方法是基于高表达基因VP11建立的，与目前基于VP1和VP6(两者表达水平低于VP11)建立的检测方法相比，具有明显的优势。此外，普通RT
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PCR和套式RT
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PCR检测的灵敏性又低于定量PCR。因此，综合来看该检测方法灵敏性高于目前存在的MCRV检测方法。
[0010]本专利技术提供了一种高灵敏性MCRV检测试剂盒，该检测试剂盒的检测技术灵敏性高，特别适用于MCRV含量较低的青蟹苗种和受精卵病毒检测。本专利技术前期研究发现，MCRV是一种条件性病原，青蟹个体、受精卵及蚤状幼体均易携带该病原，但仅在外界环境适合时，才会导致病毒大量增殖，引起青蟹和幼体死亡。通常情况下，青蟹受精卵及其幼体病毒含量较低，需要高灵敏的检测方法，才能避免假阴性出现。此外，苗种带毒，容易千里传毒，造成难以估量的损失，因此对苗种是否携带MCRV要求非常苛刻，该检测技术检测极限已达2.5拷贝/反应，能很好的满足苗种病原检测的需要。
[0011]基于上述技术方案，本专利技术的第一方面，提供一种应用于青蟹苗种呼肠孤病毒检测的qRT
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PCR试剂盒，所述的试剂盒检测青蟹呼肠孤病毒基因组片段 11(VP11)的ORF区，引物设计参考MCRV基因组VP11节段序列(GenBank 编号HQ414137.1)及另外两个分离毒株VP11节段序列(SsRV，GenBank编号HQ414137.1；MCRV
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NH，SEQ ID NO:4)，在VP11基因ORF区内部保守区域设计定量引物。
[0012]MCRV检测的最优靶标序列为病毒基因组片段11(VP11)的ORF区。 MCRV共表达13个基因，通过实验比较了MCRV中13个基因的相对表达水平，发现VP11基因表达水平最高，VP12基因次之，实验结果见图1。基于高表达基因设计定量引物，能从本底水平上提高病原检测的灵敏度。文献报道的 MCRV检测方法主要是基于VP1或VP6，这两个基因表达水平显著低于VP11，意味着基于VP11建立的检测方法的起点高。
[0013]进一步的，所述的试剂盒包括基于VP11的ORF区设计的一对特异性引物，上、下游引物序列分别为：上游引物MCRVRF序列为5
′–
GTC AGA ATG TCGTTC ATA CTT TGT
–3′
(SEQ ID NO:1)，下游引物MCRVRR序列为5
′–
ATT CAGGAG TTC CGG ACA GAT
–3′
(SEQ ID NO:2)。
[0014]进一步的，所述的试剂盒还包括基于VP11的特异的TaqMan探针，探针序列VP11
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Probe：5
′–
FAM
‑
CTG ATG CGT TCG ATT
‑
MGB
–3′
(SEQ ID NO:3)。
[0015]进一步的，所述的试剂盒还包括含有适于荧光探针的Taq酶预混试剂(例如，2
×
Premix Ex Taq(Probe qPCR))，反转录酶预混试剂(例如，Primescript RTMaster Mix，含随机引物Random6)，梯度稀释的标准品质粒，阳性对照，阴性对照(灭菌双蒸水)。
[0016]所述的试剂盒所包含的Taq酶预混试剂和反转录试剂均本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种应用于青蟹苗种呼肠孤病毒检测的qRT
‑
PCR试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒检测青蟹呼肠孤病毒基因组片段VP11的ORF区；所述的试剂盒包括一对特异性引物，上、下游引物序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括特异的TaqMan探针，探针序列如SEQ ID NO:3所示。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括含有适于荧光探针的Taq酶预混试剂和含随机引物Random6的反转录酶预混试剂。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的PCR反应体系为：2
×
Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，VP11
‑
F和VP11
‑
R各0...

【专利技术属性】
技术研发人员：李新苍，秦闯，赵姝，周俊芳，房文红，王元，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院东海水产研究所，
类型：发明
国别省市：