本发明专利技术公开了一种用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合及其应用。所述引物探针组合包括甲型流感病毒的引物和探针以及乙型流感病毒的引物和探针。本发明专利技术开发恒温扩增快速检测甲、乙流病毒的引物探针组合，所述引物探针组合具有良好的灵敏度，能在20min内快速、高特异性地检测到低浓度模板，不易产生由高温引起的气溶胶污染，另外，且恒温检测仪器价格相对低廉，便于广泛推广应用。便于广泛推广应用。便于广泛推广应用。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合及其应用
[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合及其应用。
技术介绍
[0002]流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，传染性强，传播速度快，容易引起大范围流行。流感病毒属于正粘液病毒科，可分为甲、乙、丙型流感病毒三型。其中，甲型流感病毒经常发生抗原变异、传染性强，最易引起大范围流行，乙型次之，丙型极少引起流行。由于流感病毒引起的感染症状和流行特点相似，仅靠临床症状无法对病原进行区分，实验室主要通过病毒分离、抗原检测与核酸检测等方法进行常规诊断。目前，主要通过荧光PCR单重核酸检测试剂盒对甲型流感病毒、乙型流感病毒进行检测。
[0003]如CN102251061A公开一种甲型/乙型流感病毒核酸双重荧光PCR检测试剂盒包括RNA酶抑制剂、RT
‑
PCR反应液、酶混合液、甲型/乙型流感病毒双重反应液、阳性对照和阴性对照，其中，所说的甲型/乙型流感病毒双重反应液包括以下组分：组分(1)：由一对检测甲型流感病毒的引物和一条检测甲型流感病毒的探针组成；组分(2)：由一对检测乙型流感病毒的引物和一条检测乙型流感病毒的探针组成；所说的酶混合液包括Taq酶和逆转录酶。能够同时检测出甲型、乙型流感病毒，解决了现有产品只能在一管反应中检测一种流感病毒的问题，但整个实验流程至少需要2.5～3小时，且需要配备复杂的仪器，不利于在基层医院推广。
[0004]综上所述，如何提供一种灵敏度高、特异性好、操作简便、检测时间短的甲型流感病毒、乙型流感病毒检测产品已成为亟待解决的问题。
技术实现思路
[0005]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合及其应用，本专利技术开发恒温扩增快速检测甲、乙流病毒的引物探针组合，所述引物探针组合具有良好的灵敏度，能在20min内快速、高特异性地检测到低浓度模板，不易产生由高温引起的气溶胶污染，另外，且恒温检测仪器价格相对低廉，便于广泛推广应用。
[0006]为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合，所述引物探针组合包括甲型流感病毒的引物和探针以及乙型流感病毒的引物和探针，所述甲型流感病毒的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列，所述甲型流感病毒的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列，所述乙型流感病毒的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列，所述乙型流感病毒的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列。
[0008]本专利技术中，开发恒温扩增快速检测甲、乙型流感病毒的引物探针组合，设计特定的引物、探针序列，其中探针的结构包括从5
’
端到3
’
端顺次连接的5
’
端序列、荧光发生基团、四氢呋喃、间隔序列、荧光淬灭基团、3
’
端序列和C3阻断基团，获得具备高灵敏度和特异性的引物、探针组合，能在恒温条件下20min内快速、高特异性地检测到低浓度模板，检测时间短、灵敏度高，且不易产生由高温引起的气溶胶污染，此外，使用恒温检测仪器相对低廉的价格为相关产品在基层技术条件落后地区的应用提供了条件。
[0009]优选地，所述甲型流感病毒的探针和乙型流感病毒的探针的各自独立地包括荧光发生基团和荧光淬灭基团。
[0010]优选地，所述荧光发生基团包括FAM、ROX或CY5中的任意一种。
[0011]优选地，所述荧光淬灭基团包括BHQ1或BHQ2。
[0012]SEQ ID NO.1：CGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAG。
[0013]SEQ ID NO.2：AATAACTGAGTGCTATTTCTTTGGCCCCATGG。
[0014]SEQ ID NO.3：
[0015]GCCCTTAATGGGAATGGGGATCCAAATAAT
‑
(THF)
‑
TGGACAGAGCAGTCA。
[0016]SEQ ID NO.4：CACCTGTCTTGTTCTCCAACAAAATAGCCAGATTAGG。
[0017]SEQ ID NO.5：TATTCCTTGTTTCCAATGTTTTTGATGCCTAGTGCTGC。
[0018]SEQ ID NO.6：
[0019]TCCTGATCTGTTCAGCATACCATTAGAAAGATAT
‑
(THF)
‑
TGAAGAAACAAGGGC。
[0020]THF为四氢呋喃。
[0021]第二方面，本专利技术提供第一方面所述的用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合在制备检测甲型和乙型流感病毒的产品中的应用。
[0022]第三方面，本专利技术提供一种检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合。
[0023]优选地，所述试剂盒还包括RPA扩增反应液、阳性对照和阴性对照。
[0024]优选地，所述RPA扩增反应液包括包括缓冲液、酶混合物和激活剂。
[0025]优选地，所述缓冲液含有Tris
‑
HCl、EDTA、KCl、dNTP、dATP、DTT、肌酸激酶和磷酸肌酸，进一步优选地，所述缓冲液含有100mM Tris
‑
HCl(pH7.6)、0.1mM EDTA、50mM KCl、200nM dNTP、2mM dATP、2mM DTT、0.2mg/mL肌酸激酶和50mM磷酸肌酸。
[0026]优选地，所述酶混合物含有结合单链核酸的逆转录酶、重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶和解旋酶。
[0027]优选地，所述激活剂包括MgCl2，浓度可以为5～20mM，包括但不限于6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、15mM、17mM、18mM或19mM。
[0028]优选地，所述阳性对照包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的核酸片段。
[0029]优选地，所述阴性对照包括无菌水。
[0030]本专利技术中，所述阳性对照可选择甲型流感病毒M1基因序列片段和乙型流感病毒PB1基因序列片段，可以理解，为便于保存和应用，可将相应基因序列插入质粒载体中。
[0031]第四方面，本专利技术提供第一方面所述的用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合在以非疾病诊断为目的检测甲型流感病毒和乙型流感病毒中的应用。
[0032]第五方面，本专利技术提供一种以非疾病诊断为目的检测甲型流感病毒和乙型流感病
毒的方法，所述方法包括：
[0033]以待测样本中核酸为模板本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括甲型流感病毒的引物和探针以及乙型流感病毒的引物和探针；所述甲型流感病毒的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列；所述甲型流感病毒的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列；所述乙型流感病毒的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列；所述乙型流感病毒的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列。2.根据权利要求1所述的用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合，其特征在于，所述甲型流感病毒的探针和乙型流感病毒的探针的各自独立地包括荧光发生基团和荧光淬灭基团；优选地，所述荧光发生基团包括FAM、ROX或CY5中的任意一种；优选地，所述荧光淬灭基团包括BHQ1或BHQ2。3.权利要求1或2所述的用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合在制备检测甲型和乙型流感病毒的产品中的应用。4.一种检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合。5.根据权利要求4所述的检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RPA扩增反应液、阳性对照和阴性对照；优选地，所述RPA扩增反应液包括包括缓冲液、酶混合物和激活剂；优选地，所述缓冲液含有Tris
‑
HCl、EDTA、KCl、dNTP、dATP、DTT、肌酸激酶和磷酸肌酸；优选地，所述酶混合物含有结合单链核酸的逆转录酶、重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶和解旋酶；优选地，所述激活剂包括MgCl2；优选地，所述阳性对照包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的核酸片段...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪梦竹，王博伟，林灵，汪帅男，吴煜，赵江曼，吕芳，陶维维，楼敬伟，
申请(专利权)人：上海华藤生物科技有限公司上海宝藤医学检验所有限公司上海张江医学创新研究院，
类型：发明
国别省市：
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