本发明专利技术公开了一种添加犬血清优化的通用型生物分析方法，包括步骤:准备通用型包被抗体缓冲液，孵育过夜；加入封闭缓冲液孵育并加入两套相同的一定梯度待测物，再将含有犬血清和不含犬血清的检测抗体工作液分别加入待测物中；显色并终止，在酶标仪处理后对比每组数据的背景值、灵敏度。本方法可以克服犬血清或者犬血浆中通用型方法一般的背景值会相对高，进而影响方法的灵敏度且不利于低剂量组动物暴露量检测的问题。本方法通过添加犬血清可以有效改善通用型生物分析方法的背景值和优化灵敏度，且无论包被抗体是一般的抗人Fc抗体还是抗特定片段的多克隆抗体，本方法均是有效的。的。
【技术实现步骤摘要】
一种添加犬血清优化通用型生物分析的方法
[0001]本专利技术涉及生物分析
，特别涉及一种添加犬血清优化通用型生物分析的方法。
技术介绍
[0002]大分子生物分析方法中灵敏度的考察是一项重要的指标，也是目前FDA、NMPA和OECD的建议对生物分析方法必须要验证的参数。FDA中描述LLOO定义了方法的灵敏度应该在方法开发期间确定，并且开发和验证该灵敏度，使其能够满足预期生物样本检测的要求。NMPA也描述灵敏度是能够被可靠定量的样品中分析物的最低浓度，具有可接受的准确度和精密度。灵敏度是标准曲线的最低点，应适用于预期的浓度和试验目的。而背景值如果很高，一般最直观的显示出此方法受基质的影响很大，也会侧面的影响方法中灵敏度的准确度和精密度。
[0003]降低高背景信号值的方式有很多，例如增大最小稀释倍数、改变封闭液、更换试剂甚至更换方法。但是增大最小稀释倍数减少基质含量以达到降低基质的干扰作用的缺点是同时可能会造成灵敏度的下降，改变封闭液可能会增大方法成本，更换试剂和方法的方式可能会使通用型的方法因药物不同而不适用。
[0004]为了使通用性方法可以为每个药物提供检测途径，掌握有效降低背景值及优化灵敏度的解决方式，才能保证通用型生物分析方法开发的有效性，保证后续的方法验证和样品分析的有效进行。
[0005]同时，临床前药效动力学中对全药的检测也具有非常重要的意义。对不同的药物进行检测，使用已建立的通用型方法，具有不仅可以节约时间还可以节约试剂成本的优点。但是目前的通用型方法会普遍遇到的问题是背景值高，灵敏度相对较低。
[0006]目前使用通用型方法会大大的降低一些临床前样品分析的时间成本和试剂成本，通用型方法的试剂选择环节尤为重要。但犬血清或者犬血浆中通用型方法一般的背景值会相对高，进而影响方法的灵敏度，不利于低剂量组动物暴露量的检测。
技术实现思路
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种添加犬血清优化通用型生物分析的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0008]S1.将通用型包被抗体缓冲液加至高吸附板中，孵育过夜；用洗液洗板后加入封闭缓冲液，室温孵育；再用洗液洗板后加入两套相同的待测物，室温孵育；
[0009]S2.分别配制含有犬血清的检测抗体工作液和不含犬血清的检测抗体工作液并分别加入待测物中室温孵育；
[0010]S3.显色并终止，在酶标仪处理后对比每组数据的背景值、灵敏度。
[0011]作为本专利技术优选的技术方案，步骤S1中，所述通用型包被抗体缓冲液的制备方法为：分别准备抗人Fc段的多克隆抗体和抗人CH2段的多克隆抗体，使用碳酸盐缓冲液配制包
被抗体缓冲液。
[0012]作为本专利技术优选的技术方案，步骤S1中，所述洗液为含有0.05％～0.1％Tween的PBS；所述封闭缓冲液为3％～5％BSA；所述待测物为在犬血清中配制的含有梯度为5000
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10ng/mL的药物，并使用1％BSA进行50倍的预稀释。
[0013]作为本专利技术优选的技术方案，步骤S1中，所述高吸附板为96孔板，每孔加入100微升通用型包被抗体缓冲液，在2～8℃孵育过夜。
[0014]作为本专利技术优选的技术方案，步骤S1中，用洗液洗板3
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5次后拍干，每孔加入300微升封闭缓冲液，室温下孵育1～3小时。
[0015]作为本专利技术优选的技术方案，步骤S1中，用洗液洗板3
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5次后拍干，每孔加入100微升待测物，400
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600转/秒转速下室温孵育2小时。
[0016]作为本专利技术优选的技术方案，步骤S2中，所述含有犬血清的检测抗体工作液的配制方法为1：20000倍稀释在含5％犬血清的1％BSA中；所述不含有犬血清的检测抗体工作液的配制方法为1：20000倍稀释在1％BSA中。
[0017]作为本专利技术优选的技术方案，步骤S2中，在所述高吸附板对应的孔中每孔加入100微升检测抗体工作液，400
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600转/秒转速下室温孵育1小时。
[0018]作为本专利技术优选的技术方案，在步骤S1和步骤S2之间增加如下步骤：用洗液洗板3
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5次后拍干。
[0019]作为本专利技术优选的技术方案，所述洗液为含有0.05％～0.1％Tween的PBS洗液，在所述高吸附板对应的孔中每孔加入300微升洗液，洗板3
‑
5次后拍干。
[0020]作为本专利技术优选的技术方案，步骤S2中，所述显色并终止具体为：在所述高吸附板对应的孔中每孔加入100微升TMB室温下避光显色，在370nm波长下酶标仪读最大浓度值为1.4
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1.6小时，每孔加入100微升2NHSO；终止。
[0021]作为本专利技术优选的技术方案，步骤S3中，所述在酶标仪处理后对比每组数据的背景值、灵敏度，具体为：在450nm波长下读取最终数据，在酶标仪上按照试验条件设置模板处理拟合曲线处理数据，并比较每组数据的背景值、灵敏度。
[0022]作为本专利技术优选的技术方案，其特征在于，在步骤S2和步骤S3之间增加如下步骤：用洗液洗板3
‑
5次后拍干。
[0023]作为本专利技术优选的技术方案，所述洗液为含有0.05％～0.1％Tween的PBS洗液，在所述高吸附板对应的孔中每孔加入300微升洗液，洗板3
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5次后拍干。
[0024]通过上述技术方案，本专利技术的有益效果在于:
[0025]本专利技术通过添加犬血清可以有效改善通用型生物分析方法的背景值和优化灵敏度，且无论包被抗体是一般的抗人Fc抗体还是抗特定片段的多克隆抗体，本方法均是有效的。本方法可以克服犬血清或者犬血浆中通用型方法一般的背景值会相对高，进而影响方法的灵敏度，不利于低剂量组动物暴露量的检测的问题。经实验验证证明，检测抗体工作液为抗人F(ab)z多克隆抗体，加入犬血清至检测抗体中后，会中和检测抗体中同源于犬IgG的成分，灵敏度和背景值的改善非常明显，使背景值大大降低，起到优化方法的作用。同时比较捕获抗体为一般的抗人的Fc多克隆抗体和特异性抗人CH2片段的多克隆抗体之间的区别，更加佐证试剂之间的改变使在检测抗体中加入犬血清均为有效的。
具体实施方式
[0026]以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。
[0027]一、实验步骤
[0028]添加犬血清优化通用型生物分析的方法包括以下步骤:
[0029]S1、分别准备抗人Fc段的多克隆抗体和抗人CH2段的多克隆抗体，使用碳酸盐缓冲液配制2μg/mL包被缓冲液，并在96孔板对应的孔中每孔加入100L后放置2～8℃下孵育过夜；
[0030]S2、在96孔板对应的孔中每孔加入300微升含有0.5％Tween的PBS洗液，洗板3次后拍干；在96孔板的每孔加入300微升3％BSA封闭缓冲液，室温下孵育1～3小时；
[0031]S3、在96孔板对应的孔中本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种添加犬血清优化通用型生物分析的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.将通用型包被抗体缓冲液加至高吸附板中，孵育过夜；用洗液洗板后加入封闭缓冲液，室温孵育；再用洗液洗板后加入两套相同的待测物，室温孵育；S2.分别配制含有犬血清的检测抗体工作液和不含犬血清的检测抗体工作液并分别加入待测物中室温孵育；S3.显色并终止，在酶标仪处理后对比每组数据的背景值、灵敏度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述通用型包被抗体缓冲液的制备方法为：分别准备抗人Fc段的多克隆抗体和抗人CH2段的多克隆抗体，使用碳酸盐缓冲液配制包被抗体缓冲液。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述洗液为含有0.05％～0.1％Tween的PBS；所述封闭缓冲液为3％～5％BSA；所述待测物为在犬血清中配制的含有梯度为5000
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10ng/mL的药物，并使用1％BSA进行50倍的预稀释。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述高吸附板为96孔板，每孔加入100微升通用型包被抗体缓冲液，在2～8℃孵育过夜。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S1中，用洗液洗板3
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5次后拍干，每孔加入300微升封闭缓冲液，室温下孵育1～3小时。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S1中，用洗液洗板3
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5次后拍干，每孔加入100微升待测物，400
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600转/秒转速下室温孵育2小时。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述含有犬血清的检测抗体工作液的配制方法为1：20000倍稀释在含5％犬血清的1％B...
【专利技术属性】
技术研发人员：权腾飞，崔启华，周峰，赵萌军，谈伟锋，周丹丹，
申请(专利权)人：熙华太仓新药开发有限公司，
类型：发明
国别省市：
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