基于Blocker的基因突变检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于Blocker的基因突变检测试剂盒及其应用，基于Blocker的基因突变检测试剂盒包括Blocker探针和Rnase H，Blocker探针为含有核糖核苷酸碱基的DNA寡核苷酸序列；Blocker探针与背景DNA模板结合，其核糖核苷酸碱基与背景DNA不互补，Rnase H无法切割Blocker探针；Blocker探针与突变DNA模板结合，Blocker探针序列中核糖核苷酸碱基与模板互补，Rnase H切割Blocker探针中的核糖核苷酸碱基，Blocker断裂成两部分短序列。本发明专利技术制备的基于Blocker的基因突变检测试剂盒可以用来检测碱基置换、移码、缺失和插入基因突变，具有灵敏度高、特异性好、封闭效果好、通用性好的优势。优势。优势。

【技术实现步骤摘要】
基于Blocker的基因突变检测试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种基于Blocker的基因突变检测试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]基因突变常见形式有碱基置换、移码、缺失和插入突变，伴随着现代临床医学诊断的发展，基因检测越来越广泛地被应用。
[0003]肿瘤突变，分为胚系突变和体系突变。胚系突变为性细胞突变，可以遗传给下一代，但是体系突变不遗传。体系突变可能会引起人体体细胞的一些遗传结构改变，与疾病发病相关联，但是体系突变发生率比较低，因此在大量的体细胞中存在着很少的突变体细胞。
[0004]在肿瘤患者的体系突变中，含有少量的突变DNA，可用于疾病发病标志物、用药指导、预后监测等功能，但是被大量的正常背景DNA干扰，因此有效排除正常背景DNA的干扰，正确检测出突变DNA的意义非常重要。
[0005]扩增阻滞PCR（ARMS
‑
PCR），目前常用于肿瘤突变DNA的检测，能够有效的降低背景DNA的干扰，但是依然存在着各种特异性不足和灵敏度低的问题。为了解决此问题，后续人们引入了Blocker探针来进一步封闭背景DNA的结合位点，避开引物的退火扩增，在特异性和灵敏度上有了一定的提升，但是依然不能满足现有临床检测的需求。因此急需开发一种高灵敏度、高特异性的基因检测方法应用于临床检测。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中检测基因突变的方法特异性和灵敏度低的问题，本专利技术提供了一种基于Blocker的基因突变检测试剂盒及其应用，可以用来检测碱基置换、移码、缺失和插入基因突变，具有灵敏度高、特异性好、封闭效果好、通用性好的优势。
[0007]本专利技术通过以下技术方案实现：一种基于Blocker的基因突变检测试剂盒，包括Blocker探针和Rnase H，Blocker探针为含有核糖核苷酸碱基的DNA寡核苷酸序列；Blocker探针与背景DNA模板结合，其核糖核苷酸碱基与背景DNA不互补，Rnase H无法切割Blocker探针；Blocker探针与突变DNA模板结合，Blocker探针序列中核糖核苷酸碱基与模板互补，Rnase H 切割Blocker探针中的核糖核苷酸碱基，Blocker断裂成两部分短序列。
[0008]进一步地，所述的Blocker探针为含有核糖核苷酸碱基的DNA寡核苷酸序列，长度为18
ꢀ‑
30 bp，T
m
为50
‑
70℃，含有的核糖核苷酸碱基数量为1~10bp；所述的核糖核苷酸碱基在Blocker探针序列中核糖核苷酸的5
’
端方向含有3个或3个以上的脱氧核糖核苷酸碱基，核糖核苷酸碱基在Blocker探针序列中核糖核苷酸的3
’
端方向含有3个或3个以上的脱氧核糖核苷酸碱基。
[0009]进一步地，所述的试剂盒还包括上游靶标引物、下游靶标引物、荧光探针；所述的上游靶标引物为扩增阻滞引物，下游靶标引物为普通引物；
进一步地，所述的Blocker探针3
’
端修饰有3'
‑
Spacer C3、3'
‑
Phosphat、3'
‑
ddC或3'
‑
Inverted End。
[0010]进一步地，所述的Rnase H为Rnase H1或Rnase H2。
[0011]进一步地，所述的上游靶标引物长度为13~26bp，T
m
值为40~60℃；所述的上游靶标引物长度为13~26bp，T
m
值为40~60℃。
[0012]本专利技术中，所述的基于Blocker的基因突变检测试剂盒在基因突变检测中的应用；Blocker探针能够有效彻底封阻背景DNA的干扰，即使与靶标DNA模板非特异性结合后，也能被Rnase H作用接触封阻效用，灵敏度高、特异性好、封闭彻底，通用性好本专利技术中的Blocker探针与背景干扰DNA模板结合，Blocker探针序列中核糖核苷酸碱基与背景模板不互补，Rnase H无法切割Blocker，Blocker阻碍了引物的退火，造成引物无法退火延伸，机理图如下图1所示；Blocker探针与靶标DNA模板结合，Blocker探针序列中核糖核苷酸碱基与模板互补，Rnase H 切割Blocker中的核糖核苷酸碱基，Blocker断裂成两部分短序列，无法继续退火，引物退火结合DNA模板，延伸，水解荧光探针，机理图如下图2所示；有益效果本专利技术中的Blocker探针为含有核糖核苷酸碱基的DNA寡核苷酸序列，与Rnase H作用，Blocker探针能够有效彻底封阻背景DNA的干扰，即使与靶标DNA模板非特异性结合后，也能被Rnase H作用接触封阻效用，灵敏度高、特异性好、封闭彻底，通用性好。
附图说明
[0013]图1为Blocker探针与背景DNA结合时的机理图；图2为Blocker探针与靶标DNA结合时的机理图；图3为实施例2 EGFR（T790M）基因突变DNA和未突变DNA扩增曲线图；图4为对比例1 EGFR（T790M）基因突变DNA和未突变DNA扩增曲线图；图5为对比例2 EGFR（T790M）基因突变DNA和未突变DNA扩增曲线图。
具体实施方式
[0014]下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。
[0015]本专利技术中基于Blocker的基因突变检测试剂盒包括Blocker探针和Rnase H（Rnase H1或Rnase H2），Blocker探针为含有核糖核苷酸碱基的DNA寡核苷酸序列，长度为18
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30 bp，Tm值为50~70℃核糖核苷酸碱基数量为1~10bp；Blocker探针与背景干扰DNA模板结合，Blocker序列中核糖核苷酸碱基与背景模板不互补，Rnase H无法切割Blocker，Blocker阻碍了引物的退火，造成引物无法退火延伸；Blocker探针与靶标DNA模板结合，Blocker探针序列中核糖核苷酸碱基与模板互补，Rnase H 切割Blocker中的核糖核苷酸碱基，Blocker断裂成两部分短序列，无法继续退火，引物退火结合DNA模板，延伸，水解荧光探针。
[0016]本专利技术中基因突变检测试剂盒还包括上游靶标引物、下游靶标引物、荧光探针；上游靶标引物为扩增阻滞引物，长度为13~26bp，Tm值为40~60℃；下游靶标引物为普通引物，
长度为13~26bp，Tm值为40~60℃；核糖核苷酸碱基在Blocker探针序列中核糖核苷酸的5
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端方向含有3个或3个以上的脱氧核糖核苷酸碱基，核糖核苷酸碱基在Blocker探针序列中核糖核苷酸的3
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端方向含有3个或3个以上的脱氧核糖核苷酸碱基，Blocker探针3
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端修饰有3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于Blocker的基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括Blocker探针和Rnase H，Blocker探针为含有核糖核苷酸碱基的DNA寡核苷酸序列；Blocker探针与背景DNA模板结合，其核糖核苷酸碱基与背景DNA不互补，Rnase H无法切割Blocker探针；Blocker探针与突变DNA模板结合，Blocker探针序列中核糖核苷酸碱基与模板互补，Rnase H 切割Blocker探针中的核糖核苷酸碱基，Blocker断裂成两部分短序列。2.根据权利要求1所述的基于Blocker的基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的Blocker探针为含有核糖核苷酸碱基的DNA寡核苷酸序列，长度为18
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30 bp，T
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为50
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70℃，含有的核糖核苷酸碱基数量为1~10bp；所述的核糖核苷酸碱基在Blocker探针序列中核糖核苷酸的5
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端方向含有3个或3个以上的脱氧核糖核苷酸碱基，核糖核苷酸碱基在Blocker探针序列中核糖核苷酸的3
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端方向含有3个或3个以上的脱氧核糖核苷酸碱基。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：金日虎，古恒森，白龙云，
申请(专利权)人：山东鲁抗好丽友生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：