一种用于从生物样本中分离活菌的密度梯度离心法制造技术

本发明专利技术提供一种用于从生物样本中分离活菌的密度梯度离心法，其包括以下步骤：将生物样本菌群样品与葡聚糖溶液依次添加至离心容器中，所述葡聚糖溶液在离心容器中形成密度梯度，进行离心处理，取所述离心处理得到的中层沉淀，得到从生物样本中分离的活菌。得到从生物样本中分离的活菌。

【技术实现步骤摘要】
一种用于从生物样本中分离活菌的密度梯度离心法


[0001]本专利技术属于微生物分离计数领域，尤其是人类肠道内容物与生物样本菌群总量梯度离心分离方法。

技术介绍

[0002]人体各个部位的细菌、古生菌、真菌和病毒组成了人体微生物群。现在大量的文献将微生物组组成与从炎症性肠病到精神分裂症的各种疾病联系起来。细菌是微生物组的丰富组成部分，特别是在肠道中，其中细菌总数约为3.8
×
10
13
。随着流行病学、病例学、组学、细胞和动物研究结果不断报道，揭示人体肠道内的微生物在相当大程度上介导了人们的代谢健康和疾病风险。肠道菌群在维持人体健康中的重要性及其与发展和进展的关系被得到公认。这包括涉及胃肠道器官的疾病(GIT)，如肠易激疾病和结肠直肠癌，但也包括涉及远端器官的疾病，如抑郁症、心血管疾病和糖尿病的发展。但目前由于肠道菌群与各疾病之间的作用机制不明，难以定点通过单一菌株或代谢产物去进行研究对疾病的帮助。人们将目光投向了用提取健康人的肠道菌群来重建因为肠道生态环境失衡引发的疾病。在此过程中，科研人员更多的关注肠道菌群在临床治疗的疗效上，而忽视了前期的肠道微生物制备和分离方法。本专利技术意在建立良好完善的粪菌微生物分离技术，将肠道菌群与生物样本中的杂质分离，尽可能保证分离出的细菌活性，从而保证后期的临床治疗能取得成效。同时，利用密度梯度离心的特性，可以有针对性的分离特定分类群的细菌，从而调整菌群结构，为针对性治疗提供技术手段。
[0003]专利文献1：CN106811425A
[0004]专利文献2：CN108430481A
[0005]专利文献1涉及一种从人体生物样本中分离肠道菌群的方法，其中采用多次离心的方法来进行生物样本中肠道菌群的分离，其先采用稀释液洗涤，后于转速为7000～15000rpm条件下离心，每次离心5～25分钟，洗涤离心1～5次，即，通过直接离心的方式进行分离，虽能达到一定的分离效果，但总体分离效果并不佳，仍存在一些难以消化的杂质物质难以分离。由于直接离心本身的物理特性，密度接近或相似的不同组分难以分开，即离心分辨率低。
[0006]专利文献2涉及一种冻干类便微生物群样品的方法，其通过利用碘克沙醇冷冻
‑
解冻而形成的碘克沙醇或5
‑
(N
‑
2,3
‑
二羟基丙基乙酰氨基)
‑
2,4,6
‑
三碘
‑
N,N'
‑
双(2,3
‑
二羟基丙基)间苯二甲酰胺的连续梯度,并在厌氧生活条件下,将来自供者受试者的类便微生物群样品包含碘克沙醇或5
‑
(N
‑
2,3
‑
二羟基丙基乙酰氨基)
‑
2,4,6
‑
三碘
‑
N,N'
‑
双(2,3
‑
二羟基丙基)间苯二甲酰胺的盐水缓冲液相混合,将获得的混合物放置于在碘克沙醇梯度之下,在厌氧生活条件下以低的加速度进行离心，在厌氧生活条件下回收离心结束时形成的细菌环或上清液。并通过反复离心去除杂质，得到纯化后的细菌粒状沉淀物。即，专利文献2采用的碘克沙醇进行密度梯度离心分离方式，但碘克沙醇为血管造影剂，用于密度梯度离心分离后的细菌将用于临床治疗，其残留物对人体可能存在危害。

技术实现思路

[0007]本申请专利技术是鉴于上述问题而完成的，本专利技术采用不同浓度的葡聚糖构建密度梯度，利用梯度离心的方法将粗滤后的生物样本
‑
生理盐水稀释液进行分离，对比测试提纯获取生物样本全菌的效果从而确定最佳浓度；对比传统直接离心的分离方法，同时对比碘克沙醇、蔗糖、氯化铯等常用密度梯度剂的分离效果，确定了使用葡聚糖对生物样本进行活菌提取有着最好的效果，其普遍适用与不同菌群结构的生物样本，且能够通过调节密度达到高度特异性定向筛选的目的。
[0008]本专利技术利用梯度离心密度灵活可控的特性，可以通过调整不同密度层液体的浓度，选择性的分离获取特定密度的物质，具有高离心分辨率的特性；同时由于离心发生在液体中，更加容易利用自动化设备完成所有操作。与专利文献1相比，本专利技术能够提高肠道菌群的分离效率，减少操作步骤，在一定程度上能减少肠道菌群液制备过程中的污染问题，避免工作人员在制备过程中的不适感。
[0009]与专利文献2相比，本专利技术使用了葡聚糖作为密度梯度剂，其作为一种益生元，能够有效的保护细菌的活性，服用后安全无害甚至可能提高菌群移植的治疗效果，同时制备过程简单，无需进行冷冻处理，分离过程步骤简化，去除了后续反复清洗的步骤，给生产工艺带来了极大的简化。
[0010]本申请专利技术的技术方案如以下所示。
[0011]本专利技术的第一方面提供一种用于从生物样本中分离活菌的密度梯度离心法，其包括以下步骤：
[0012]将生物样本菌群样品与葡聚糖溶液依次添加至离心容器中，所述葡聚糖溶液在离心容器中形成密度梯度，进行离心处理，取所述离心处理得到的中层沉淀，得到从生物样本中分离的活菌，优选地，所述生物样本为粪便。
[0013]在一个实施方式中，所述葡聚糖溶液为充分溶解有葡聚糖的PBS溶液。
[0014]在一个实施方式中，所述密度梯度离心法还包括在所述离心管下层加入所述葡聚糖溶液的步骤。
[0015]在一个实施方式中，所述葡聚糖溶液的浓度为40％～80％，优选地，浓度为50％～70％，优选地，浓度为40％～50％(w/v)，或浓度为50％～60％(w/v)，或浓度为60％～70％(w/v)，或40％、或50％、或60％、或70％；优选地，所述离心处理的离心条件为3000g～10000g、4℃～20℃、5分钟～20分钟，优选为5000g～8000g、4℃～15℃、7分钟～18分钟，更优选为6000g、4℃、10分钟。
[0016]在一个实施方式中，所述生物样本包括来自于土壤、污水、食物样本、粪便的菌群，优选地，所述生物样本通过以下步骤制备：将来自于土壤、污水、食物样本、粪便的所述生物样本混悬于生理盐水得到混悬液，对所述混悬液进行粗过滤；将所述粗过滤得到的生物样本
‑
生理盐水混悬液加入所述离心管；优选地，所述生物样本包括来自于粪便的菌群。
[0017]在一个实施方式中，所述密度梯度离心法还包括在所述离心处理完成后，对离心管进行拍照记录并转移回厌氧台进行取样，记录不同分层的样本体积的步骤。
[0018]在一个实施方式中，所述密度梯度离心法还包括在所述离心处理完成后，对离心处理所得的每个离心层级进行流式细胞仪检测，鉴定所述每个离心层级样本中的活菌数的步骤。
[0019]在一个实施方式中，所述密度梯度离心法包括以下步骤：
[0020](1)称取葡聚糖，使其溶解于PBS中，充分溶解后静置，得葡聚糖溶液，
[0021](2)将所述生物样本混悬于生理盐水得到混悬液，对所述混悬液进行粗过本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于从生物样本中分离活菌的密度梯度离心法，其特征在于，包括以下步骤：将生物样本菌群样品与葡聚糖溶液依次添加至离心容器中，所述葡聚糖溶液在离心容器中形成密度梯度，进行离心处理，取所述离心处理得到的中层沉淀，得到从生物样本中分离的活菌。2.根据权利要求1所述的用于从生物样本中分离特定活菌的密度梯度离心法，其特征在于，所述葡聚糖溶液为充分溶解有葡聚糖的PBS溶液。3.根据权利要求1或2所述的用于从生物样本中分离特定活菌的密度梯度离心法，其特征在于，还包括在所述离心管下层加入所述葡聚糖溶液的步骤。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的用于从生物样本中分离特定活菌的密度梯度离心法，其特征在于，所述葡聚糖溶液的浓度为40％～80％，优选地，浓度为50％～70％，优选地，浓度为40％～50％(w/v)，或浓度为50％～60％(w/v)，或浓度为60％～70％(w/v)，或40％、或50％、或60％、或70％；优选地，所述离心处理的离心条件为3000g～10000g、4℃～20℃、5分钟～20分钟，优选为5000g～8000g、4℃～15℃、7分钟～18分钟，更优选为6000g、4℃、10分钟。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的用于从生物样本中分离特定活菌的密度梯度离心法，其特征在于，所述生物样本包括来自于土壤、污水、食物样本、粪便的菌群，优选地，所述生物样本通过以下步骤制备：将来自于土壤、污水、食物样本、粪便的所述生物样本混悬于生理盐水得到混悬液，对所述混悬液进行粗过滤；将所述粗过滤得到的生物样本
‑
生理盐水混悬液加入所述离心管；优选地，所述生物样本包括来自于粪便的菌群。6.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的用于从生物样本中分离特定活菌的密度梯度离心法，其特征在于，包括以下步骤：(1)称取葡聚糖，使其溶解于PBS中，充分溶解后静置，得葡聚糖溶液，(2)将所述生物样本混悬于生理盐水得到混悬液，对所述混悬液进行粗...

【专利技术属性】
技术研发人员：张聪，李棒，高婷，谭验，
申请(专利权)人：深圳科君生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：