一种高稳定性磁珠的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高稳定性磁珠的制备方法，涉及免疫化学检测技术领域。本发明专利技术通过利用双端官能团交联剂和惰性蛋白将要修饰的抗体偶联在磁珠上，一方面减少抗体对磁珠表面的物理吸附，同时双官能团交联剂又可以将物理吸附的抗体与共价连接的蛋白交联在一起形成网络结构，最终起到提高磁珠稳定性的作用。本发明专利技术提供的方法是基于双端官能团交联剂和惰性蛋白偶联的方法，通过减少蛋白在磁珠表面的物理吸附和增强物理吸附抗体与磁珠的连接，使偶联的抗体尽可能多的共价连接并固定在磁珠上，从而提高磁珠的稳定性。与常规工艺得到的磁珠相比，本发明专利技术的方法能显著提高磁珠的稳定性，减少抗体的脱落，且操作简单，省时。省时。省时。

【技术实现步骤摘要】
一种高稳定性磁珠的制备方法


[0001]本专利技术涉及免疫化学检测
，尤其涉及一种高稳定性磁珠的制备方法。

技术介绍

[0002]磁微粒一般指尺寸在微米及纳米级的球形复合物，是通过适当的方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的复合微球。其最为突出的特点是具有超顺磁性，能够被外加磁场磁化，撤去外加磁场后，磁性同时消失。这一特性使磁性微纳米材料具有能够在外加磁场作用下运动聚集，同时在去掉外加磁场后又重新分散的能力，成为一种接近完美的生物分离载体。
[0003]磁微粒的专利技术构想最初来自于挪威科技大学的化学家JohnUgelstad，他在1976年以聚苯乙烯为主要材料，制造出均匀磁化的球体粒子。目前科学家们不仅可以精准控制磁珠的粒径大小，开发1
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100μm粒径大小的磁珠，而且磁珠表面官能团种类也丰富很多，广泛用于细胞分离，核酸提取，生物医药的靶点鉴定及代谢性质研究和蛋白纯化与免疫分析。
[0004]目前磁微粒在体外诊断的各个
也被广泛应用。如磁微粒化学发光免疫分析技术(CLIA)。CLIA用的磁珠粒径在1
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3μm左右，磁珠制备技术成熟且比较知名的磁珠厂家有德国Merck，日本JSR，美国Dynabeads等。CLIA对磁珠的性能基本要求如下：磁响应速度快，含磁量高；分散性好、沉降速度慢；化学稳定性高，非特异性吸附低，信噪比高；基团含量高，键合力强，灵敏度高。
[0005]磁微粒根据表面官能团的不同可以分为羧基磁珠，甲苯磺酰基磁珠，氨基磁珠，环氧基磁珠，链酶亲和素磁珠(SA
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MB)等。其中甲苯磺酰基磁珠由于其在偶联抗体过程中无需加入活化剂，操作简单方便，工艺批间差可控，且工艺易放大而被广泛应用于体外诊断领域用来标记抗原抗体。但甲苯磺酰基磁珠的疏水性比较强，在偶联蛋白的同时会有一部分蛋白以物理吸附的形式固定到磁珠上，随着时间的延长，这部分物理吸附的蛋白会发生脱落，对磁珠的长期稳定性造成影响，进而影响试剂的加速稳定性和长期稳定性(图1)。目前人们常用在高温37
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45℃的条件下多次清洗的方法来除去磁珠表面物理吸附不牢固的蛋白，但这种去除方式耗时长，且存在清洗不彻底的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是如何降低磁珠表面对蛋白的物理吸附作用以及增强物理吸附蛋白与磁珠的连接，提高磁珠的稳定性。
[0007]为了解决上述问题，本专利技术提出以下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种高稳定性磁珠，所述高稳定性磁珠具有如下结构，
[0009][0010]所述磁珠为甲苯磺酰基磁珠，所述磁珠表面偶联抗体，所述抗体与磁珠通过氨基
化学反应或物理吸附连接，所述抗体与抗体之间通过交联剂连接，所述交联剂为双官能团交联剂。
[0011]进一步地，本专利技术提供的所述高稳定性磁珠具有如下结构，
[0012][0013]所述磁珠为甲苯磺酰基磁珠，所述磁珠表面偶联抗体和惰性蛋白，所述抗体与磁珠通过氨基化学反应或物理吸附连接，所述惰性蛋白与磁珠通过氨基化学反应连接，所述抗体与抗体之间、抗体与惰性蛋白之间通过交联剂连接，所述交联剂为双官能团交联剂。
[0014]进一步地，所述双官能交联剂选自戊二醛、二磺基琥珀酰亚胺基辛二酸酯、琥珀酰亚胺基辛二酸酯、庚二亚氨酸二甲酯或双官能PEG。
[0015]进一步地，所述惰性蛋白选自BSA或酪蛋白。
[0016]术语“抗体”包括各种形式的抗体结构，包括但不限于完整抗体、单克隆抗体和抗体片段。根据本专利技术的抗体优选是山羊、绵羊、小鼠、兔或大鼠抗体，嵌合抗体或进一步的基因工程抗体，只要保留根据本专利技术的特征性质。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，优选其可变结构域，或至少其抗原结合部位。抗体片段的实例包括双抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；单链抗体分子；scFv、sc(Fv)2；双抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0017]第二方面，本专利技术提供一种制备高稳定性磁珠的溶液，包括甲苯磺酰基磁珠、抗体和双官能交联剂。
[0018]本专利技术利用甲苯磺酰基磁珠表面的磺酰基与抗体上的氨基发生化学反应进行化学键连接，不需要额外的抗体偶联工艺，大部分抗体通过化学键连接在磁珠表面，连接稳定，不易发生脱落。
[0019]进一步地，所述溶液还包括惰性蛋白。
[0020]所述惰性蛋白能够结合磁珠表面多余位点，从而减少磁珠表面对抗体的物理吸附同时起到稳定抗体构象的作用，提高磁珠自身的稳定性。
[0021]进一步地，所述惰性蛋白选自BSA或酪蛋白。
[0022]进一步地，所述双官能交联剂选自戊二醛、二磺基琥珀酰亚胺基辛二酸酯(BS3)、琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)、庚二亚氨酸二甲酯(DMP)或双官能PEG。
[0023]进一步地，所述溶液还包括缓冲液。
[0024]另一方面，本专利技术提供了一种高稳定性磁珠的制备方法，包括以下步骤：
[0025]S1、清洗磁珠；
[0026]S2、将抗体投入清洗好的磁珠中，进行偶联；
[0027]S3、在S2步骤偶联后的磁珠中加入双官能团交联剂，进行交联。
[0028]进一步地，所述步骤S2中还包括，将惰性蛋白投入清洗好的磁珠中，进行偶联。
[0029]进一步地，本专利技术提供的制备方法中，步骤S1的具体方法包括：向磁珠原液中加入硼酸缓冲液，震荡混匀，磁吸附一段时间后弃去上清，重复上述洗涤过程2
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5次；
[0030]进一步地，本专利技术提供的制备方法中，步骤S2的具体方法包括：将清洗好的磁珠加入所述的硼酸缓冲液重悬，向其中投入抗体进行偶联；
[0031]进一步地，本专利技术提供的制备方法中，步骤S3的具体方法包括：将偶联后的磁珠溶液用交联缓冲液清洗2
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5次，再用交联缓冲液重悬；随后向溶液中加入双官能团交联剂溶液，震荡混匀，进行交联；
[0032]进一步地，本专利技术提供的制备方法中，交联完成之后还包括封闭的步骤，具体操作为：交联反应结束后加入封闭缓冲液清洗，然后重悬，在37℃恒温条件下封闭18
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28h，封闭结束后用保存缓冲液进行保存，得到偶联抗体的磁珠。
[0033]进一步地，所述双官能团交联剂溶液是将双官能团交联剂用DMSO或水溶解后配成，浓度为5
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20mg/mL。
[0034]进一步地，所述交联缓冲液包含100mM TEA，100mMNaCl，pH8.0；
[0035]所述封闭缓冲液包含10mM tris，0.5％BSA，pH7.4；
[0036]保存缓冲液包含10mM PBS，5％蔗糖，0.5％BSA，pH7.0。
[0037]在一实施例中制备方法具体如下：
[0038]S1、清洗磁珠；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.高稳定性磁珠，其特征在于，所述高稳定性磁珠具有如下结构，所述磁珠为甲苯磺酰基磁珠，所述磁珠表面偶联抗体，所述抗体与磁珠通过氨基化学反应或物理吸附连接，所述抗体与抗体之间通过交联剂连接，所述交联剂为双官能团交联剂。2.高稳定性磁珠，其特征在于，所述高稳定性磁珠具有如下结构，所述磁珠为甲苯磺酰基磁珠，所述磁珠表面偶联抗体和惰性蛋白，所述抗体与磁珠通过氨基化学反应或物理吸附连接，所述惰性蛋白与磁珠通过氨基化学反应连接，所述抗体与抗体之间、抗体与惰性蛋白之间通过交联剂连接，所述交联剂为双官能团交联剂。3.如权利要求1或2所述的高稳定性磁珠，其特征在于，所述双官能交联剂选自戊二醛、二磺基琥珀酰亚胺基辛二酸酯、琥珀酰亚胺基辛二酸酯、庚二亚氨酸二甲酯或双官能PEG。4.如权利要求2所述的高稳定性磁珠，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：王慧杰，
申请(专利权)人：中元汇吉生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：