用于动物健康的饲料组合物制造技术

本文尤其提供了包含耐氧埃氏巨型球菌菌株的组合物，以及制备和使用这些组合物以促进动物的一项或多项指标的改善的方法，该一项或多项指标是例如增加的体重/胴体增重、增加的饲料摄入量、降低的饲料转化率(FCR)、降低的医疗成本、减少的过渡期、减少使用抗生素和降低的死亡率。的死亡率。的死亡率。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于动物健康的饲料组合物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年2月7日提交的美国临时专利申请号62/971,503和2020年9月24日提交的美国临时专利申请号63/082,634的优先权，将每篇文献的公开内容通过引用以其全文并入本文。


[0003]本文尤其提供了饲料和饲料添加剂组合物，其包含可用于改善动物健康和/或性能、增加可用贮存期的耐氧埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)菌株直接饲喂微生物(DFM)，以及制备和使用这些饲料和饲料添加剂组合物的方法。

技术介绍

[0004]在单胃和反刍动物物种中，胃肠道和消化系统相关的微生物区系不仅参与消化和吸收，而且还与免疫和中枢神经系统相互作用以调节健康。消化道的内部涂覆有粘稠的薄层粘液，并且数百万的细菌和其他微生物包埋在该粘液层中。当细菌处于平衡(即，有益细菌的数量超过有害细菌)时，可以说消化道处于健康状态。健康的微生物群为宿主提供多种益处，包括对广谱病原体的定殖抗力、必需营养素的生物合成和吸收以及维持健康的消化道上皮和适当控制的全身免疫的免疫刺激。在“微生态失衡”或共生遭破坏的情况下，微生物群功能可能会丧失或紊乱，导致对病原体的易感性增加、代谢特征改变或促炎信号的诱导，其可能会导致局部或全身炎症或自身免疫。因此，动物胃肠道的微生物群在许多疾病和障碍(例如反刍动物的酸中毒)的发病机制中起着重要作用。
[0005]目前市场上大多数用于人类的益生菌或用于动物营养的直接饲喂微生物(DFM)可以在氧气存在的情况下生长和/或耐受氧气暴露。此类微生物的实例包括芽孢杆菌属(Bacilli)(是一类含有两个目的需氧菌)和乳杆菌属(Lactobacillus)(是兼性厌氧菌属)。然而，越来越多的下一代益生菌/DFM是对氧气敏感的专性厌氧菌。这些产品在加工、运输和储存期间的稳定性是个问题，主要是由于不能耐受氧气而导致贮存期较短。使用稳定剂进行配制和包封可以在一定程度上改善稳定性，尽管即便如此，这些产品仍表现出显著低于含有需氧微生物的相应产品的贮存期。例如，(MS生物科技公司(MSBiotec)，沃米戈(Wamego)，堪萨斯州(KS))含有专性厌氧菌埃氏巨型球菌NCIMB41125的纯培养物，并且是用于在治疗反刍动物的酸中毒中使用的有效DFM产品。然而，液体配制的LactiPro在4℃下的贮存期只有约两周，并且这种产品的不稳定性限制了LactiPro在市场上(特别是在世界上缺乏冷藏条件的地区)的使用。因此，需要用于在治疗反刍动物的与微生态失衡相关的病症(例如酸中毒)中使用的厌氧细菌，这些厌氧细菌表现出对氧气的耐受性、在氧气暴露后增加的活力以及增加的贮存期和储存期。
[0006]本文公开的主题解决了这些需求且还提供了额外的益处。

技术实现思路

[0007]本文尤其提供了包含耐氧埃氏巨型球菌菌株直接饲喂微生物(DFM)的组合物，以及制备和使用这些组合物以促进动物的一项或多项指标的改善的方法，该一项或多项指标是例如增加的体重/胴体增重、增加的饲料摄入量、降低的饲料转化率(FCR)、降低的医疗成本、降低的死亡率、减少的从饲草/草/青贮饲料饮食过渡为高精料饮食的时间、和/或降低的瘤胃酸中毒的发生率。本文公开的厌氧细菌组合物在暴露于氧气后另外表现出增加的贮存期和活力。
[0008]因此，在一些方面，本文提供了包含直接饲喂微生物(DFM)的饲料添加剂组合物，该饲料添加剂组合物包含至少一种生物学纯的耐氧埃氏巨型球菌菌株。在一些实施例中，耐氧埃氏巨型球菌在以下中包含至少一个突变：(a)编码包含SEQ ID NO:4的转录调节因子PerR的基因；或(b)紧邻编码转录调节因子PerR的基因的上游。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，至少一个突变是(a)导致PerR蛋白中氨基酸变化的核苷酸取代；和/或(b)导致移码突变的核苷酸插入。在一些实施例中，核苷酸取代位于选自由以下组成的组的核苷酸位置处：386、155、253、
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99和
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125，该核苷酸位置对应于由SEQ ID NO:4的多核苷酸序列编码的基因。在一些实施例中，核苷酸取代包含G386T、C155T、C253T、T
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99C或G
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125A。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，氨基酸变化包含对应于由SEQ ID NO:5编码的多肽的C129F、T52M或H85Y。在一些实施例中，PerP蛋白包含由SEQ ID NO:6编码的多肽。在一些实施例中，核苷酸插入位于选自由以下组成的组的核苷酸位置处：30、277和64，该核苷酸位置对应于SEQ ID NO:4。在一些实施例中，插入是位置30处的A、位置277处的A、或位置64处的G。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，组合物包含以下中的一种或多种(a)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1265的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，该埃氏巨型球菌菌株ACD1265保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(Westerdijk Fungal Biodiversity Institute，WFDI)，保藏号为CBS 146328；(b)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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A01的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(c)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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B01的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(d)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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E01的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(e)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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C02的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(f)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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C05的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(g)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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H05的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(h)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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B03的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(i)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1141
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C10的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(j)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1141
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D10的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体R本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种饲料添加剂组合物，所述饲料添加剂组合物包含含有至少一种生物学纯的耐氧埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)菌株的直接饲喂微生物(DFM)。2.如权利要求1所述的饲料添加剂组合物，其中所述耐氧埃氏巨型球菌在以下中包含至少一个突变：(a)编码包含SEQ ID NO:4的转录调节因子PerR的基因；或(b)紧邻所述编码转录调节因子PerR的基因的上游。3.如权利要求1或权利要求2所述的饲料添加剂组合物，其中所述至少一个突变是(a)导致PerR蛋白中氨基酸变化的核苷酸取代；和/或(b)导致移码突变的核苷酸插入。4.如权利要求3所述的饲料添加剂组合物，其中所述核苷酸取代位于选自由以下组成的组的核苷酸位置处：386、155、253、
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99和
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125，所述核苷酸位置对应于由SEQ ID NO:4的多核苷酸序列编码的基因。5.如权利要求4所述的饲料添加剂组合物，其中所述核苷酸取代包含G386T、C155T、C253T、T
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99C或G
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125A。6.如权利要求4或权利要求5所述的饲料添加剂组合物，其中所述氨基酸变化包含对应于由SEQ ID NO:5编码的多肽的C129F、T52M或H85Y。7.如权利要求6所述的饲料添加剂组合物，其中所述PerP蛋白包含由SEQ ID NO:6编码的多肽。8.如权利要求3所述的饲料添加剂组合物，其中所述核苷酸插入位于选自由以下组成的组的核苷酸位置处：30、277和64，所述核苷酸位置对应于SEQ ID NO:4。9.如权利要求8所述的饲料添加剂组合物，其中所述插入是位置30处的A、位置277处的A、或位置64处的G。10.如权利要求1
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9中任一项所述的饲料添加剂组合物，所述饲料添加剂组合物包含以下中的一种或多种：(a)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1265的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述埃氏巨型球菌菌株ACD1265保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDI)，保藏号为CBS 146328；(b)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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A01的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(c)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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B01的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(d)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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E01的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(e)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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C02的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(f)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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C05的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(g)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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H05的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(h)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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B03的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(i)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1141
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C10的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(j)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1141
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D10的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(k)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1141的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相
似性的16S核糖体RNA序列，所述埃氏巨型球菌菌株ACD1141保藏于WFDI，保藏号为CBS 146325；(l)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1141E的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述埃氏巨型球菌菌株ACD1141E保藏于WFDI，保藏号为CBS 146326；(m)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1141F的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述埃氏巨型球菌菌株ACD1141F保藏于WFDI，保藏号为CBS 146327；(n)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1265E的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述埃氏巨型球菌菌株ACD1265E保藏于WFDI，保藏号为CBS 146329；和/或(o)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1265F的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述埃氏巨型球菌菌株ACD1265F保藏于WFDI，保藏号为CBS146330。11.如权利要求1
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10中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述组合物包含以下中的一种或多种：(a)埃氏巨型球菌菌株ACD1265或具有埃氏巨型球菌菌株ACD1265的所有鉴别特征的活菌株；(b)埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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A01或具有埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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A01的所有鉴别特征的活菌株；(c)埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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B01或具有埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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B01的所有鉴别特征的活菌株；(d)埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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E01或具有埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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E01的所有鉴别特征的活菌株；(e)埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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C02或具有埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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C02的所有鉴别特征的活菌株；(f)埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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C05或具有埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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C05的所有鉴别特征的活菌株；(g)埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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H05或具有埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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H05的所有鉴别特征的活菌株；(h)埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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B03或具有埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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B03的所有鉴别特征的活菌株；(i)埃氏巨型球菌菌株ACD1141
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C10或具有埃氏巨型球菌菌株ACD1141
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C10的所有鉴别特征的活菌株；(j)埃氏巨型球菌菌株ACD1141
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D10或具有埃氏巨型球菌菌株ACD1141
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D10的所有鉴别特征的活菌株；(k)埃氏巨型球菌菌株ACD1141或具有埃氏巨型球菌菌株ACD1141的所有鉴别特征的活菌株；(l)埃氏巨型球菌菌株ACD1141E或具有埃氏巨型球菌菌株ACD1141E的所有鉴别特征的活菌株；(m)埃氏巨型球菌菌株ACD1141F或具有埃氏巨型球菌菌株ACD1141F的所有鉴别特征的活菌株；(n)埃氏巨型球菌菌株ACD1265E或具有埃氏巨型球菌菌株ACD1265E的所有鉴别特征的活菌株；和/或(o)埃氏巨型球菌菌株ACD1265F或具有埃氏巨型球菌菌株ACD1265F的所有鉴别特征的活菌株，将所述一种或多种菌株(A)单独培养；或(B)与衍生自这些菌株中的一种或多种的培养上清液组合。12.如权利要求10或权利要求11所述的饲料添加剂组合物，所述饲料添加剂组合物包含以下中的一种或多种：(i)细菌菌株，其具有与包含SEQ ID NO:1的埃氏巨型球菌菌株ACD1265的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(ii)细菌菌株，其具有与包含SEQ ID NO:2的埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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A01的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，或(iii)细菌菌株，其具有与包含SEQ ID NO:3的埃氏巨型球菌菌株ACD1141的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，将所述一种或多种菌株(A)单独培养；或(B)与衍生自这些菌株中的一种或多种的培养上清液组合。13.如权利要求1
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12中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述耐氧埃氏巨型球菌
在暴露于氧气至少约7
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12天后保持活力。14.如权利要求13所述的饲料添加剂组合物，其中至少约5.73x102至约1.16x 108cfu/mL的所述埃氏巨型球菌在暴露于氧气7
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12天后保持活力。15.如权利要求1
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12中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述耐氧埃氏巨型球菌在暴露于氧气后至少10天后保持活力。16.如权利要求1
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15中任一项所述的饲料添加剂组合物，其进一步包含至少一种酵母菌株和/或酵母提取物。17.如权利要求16所述的饲料添加剂组合物，其中所述酵母菌株来自酵母属(Saccharomyces)或毕赤酵母属(Pichia)或曲霉属(Aspergillus)。18.如权利要求17所述的饲料添加剂组合物，其中所述酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)或布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)或米曲霉(Aspergillus oryzae)。19.如权利要求16
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18中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中相比于单独存在，当存在所述至少一种酵母菌株和/或酵母提取物时，所述耐氧埃氏巨型球菌表现出增加的耐氧性。20.如权利要求1
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19中任一项所述的饲料添加剂组合物，其进一步包含一种或多种赋形剂。21.如权利要求20所述的饲料添加剂组合物，其中所述赋形剂包含多糖、蛋白质、抗氧化剂、或无机固体或无机油中的一种或多种。22.如权利要求20或权利要求21所述的饲料添加剂组合物，其中与缺乏所述一种或多种赋形剂的组合物相比，所述一种或多种赋形剂改善或提高饲喂牛稳定性大于约50％。23.如权利要求1
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22中任一项所述的饲料添加剂组合物，其进一步包含一种或多种酶。24.如权利要求23所述的饲料添加剂组合物，其中所述一种或多种酶选自由以下组成的组：植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、葡糖淀粉酶和β
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葡聚糖酶。25.如权利要求1
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24中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中每种埃氏巨型球菌菌株以至少约1x 103CFU/g饲料添加剂组合物到至少约1x 10
11
CFU/g饲料添加剂组合物的浓度存在。26.如权利要求1
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25中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中将所述组合物配制成液体或固体。27.如权利要求1
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26中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述组合物治疗或预防反刍动物的酸中毒。28.一种预混物，所述预混物包含如权利要求1
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27中任一项所述的饲料添加剂组合物和至少一种矿物质和/或至少一种维生素。29.一种饲料，所述饲料包含如权利要求1
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27中任一项所述的饲料添加剂组合物或如权利要求25所述的预混物。30.一种试剂盒，所述试剂盒包含a)如权利要求1
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27中任一项所述的饲料添加剂组合物；以及b)用于向动物施用的书面说明。31.如权利要求30所述的试剂盒，其进一步包含一种或多种酶。32.如权利要求31所述的试剂盒，其中所述一种或多种酶选自由以下组成的组：植酸
ID NO:5编码的多肽的C129F、T52M或H85Y。52.如权利要求51所述的方法，其中所述PerP蛋白包含由SEQ ID NO:6编码的多肽。53.如权利要求48所述的方法，其中所述核苷酸插入位于选自由以下组成的组的核苷酸位置处：30、277和64，所述核苷酸位置相对于SEQ ID NO:4。54.如权利要求53所述的方法，其中所述插入是位置30处的A、位置277处的A、或位置64处的G。55.如权利要求46
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54中任一项所述的方法，其中所述耐氧埃氏巨型球菌包含(i)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1265的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述埃氏巨型球菌菌株ACD1265保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDI)，保藏号为CBS 146328；(ii)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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A01的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(iii)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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B01的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(iv)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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E01的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(v)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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C02的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(vi)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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C05的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(vii)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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H05的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(viii)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1096
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B03的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(ix)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1141
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C10的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(x)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1141
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D10的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列；(xi)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1141的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，该埃氏巨型球菌菌株ACD1141保藏于WFDI，保藏号为CBS 146325；(xii)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1141E的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述埃氏巨型球菌菌株ACD1141E保藏于WFDI，保藏号为CBS 146326；(xiii)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1141F的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述埃氏巨型球菌菌株ACD1141F保藏于WFDI，保藏号为CBS 146327；(xiv)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1265E的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述埃氏巨型球菌菌株ACD1265E保藏于WFDI，保藏号为CBS 146329；和/或(xv)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株ACD1265F的16S核糖体DNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述埃氏巨型球菌菌株ACD1265F保藏于WFDI，保藏号为CBS146330。56.如权利要求55所述的方法，其中所述埃氏巨型球菌菌株是(i)埃氏巨型球菌菌株ACD1265或具有埃氏巨型球菌菌株ACD1265的所有鉴别特征的活菌株；(ii)埃氏巨型球菌菌株ACD109...

【专利技术属性】
技术研发人员：YX，
申请(专利权)人：杜邦营养生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：