核酸测序方法技术

本文提供了利用聚合酶、模板核酸和聚合酶试剂溶液对核酸分子进行测序的方法和系统。试剂溶液对核酸分子进行测序的方法和系统。试剂溶液对核酸分子进行测序的方法和系统。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸测序方法


[0001]本专利技术涉及单分子核酸测序的方法。

技术介绍

[0002]当前的测序技术可以分为两大类：短读长测序和长读长测序。在每一类中，将DNA切割成长度不超过一定数量的核苷酸或碱基对(bp)的片段。在所有情况下，将所有DNA片段分散成二维阵列，并通过对应于至少一个传感器与一个DNA片段匹配的传感器阵列进行检测。
[0003]短读长测序方法是基于简单循环的技术，其包括连接测序(SBL)和合成测序(SBS)。SBL方法包括SOLID(Thermo Fisher)和Complete Genomics(BGI)。使用SOLID，可以达到75个碱基对(bp)左右的读出长度，而使用Complete Genomics方法可以实现28到100个碱基对的读长。使用这些方法，结构变异和基因组组装是不可能的，并且它们易受均聚物错误的影响。它们的运行时间在几天的量级上。Illumina和Qiagen的GeneReader技术使用具有循环可逆终止的SBS方法。它们可以达到至多300bp。然而，主要缺点是富含AT和GC的区域代表性不足、子站错误和高的半阳性率。另一方面，其他SBS方法例如454焦磷酸测序和Ion Torrent(Thermo Fisher)使用单核苷酸添加/终止。454焦磷酸测序可以达到400bp，而Ion Torrent可以达到700bp的读出长度。然而，尽管这些技术速度更快并且有利于即时检测，但它们也具有许多缺点，包括插入/缺失错误居多以及均聚物区域错误。它们不能用于揭示长程基因组或转录组结构，也不能进行配对末端测序。
[0004]长读长测序方法包括两种主要类型，即合成长读长测序或实时长读长测序。Illumina和10X Genomics使用的合成长读长测序侧重于利用条码并允许大片段的计算组装的文库制备。事实上，这些技术并未做到实际的长读长，而是进行短读长，其中使用条码方法来组合DNA片段，这有助于消除分析过程中的一些复杂性，从而允许获得类似于实际长读长方法的数据。然而，这种方法的成本非常高，部分原因是它需要甚至更高的覆盖度。另一种类型的长读长测序是实时长读长测序，其已被Pacific Biosciences和Oxford Nanopore Technologies使用。与合成长读长测序不同，实时长读长测序不依赖于扩增的DNA的克隆群体，也不需要化学循环。Nanopore的技术具有30％左右的非常高的错误率，这也需要非常高的覆盖率，显著提高了成本。对于Nanopore的技术而言，使用修饰的碱基也特别具有挑战性，其产生了独特的信号，使分析甚至更加复杂。Pacific Biosciences可以达到高达4000
‑
5000bps的读出长度。然而，由于长读长的15％左右的高的单次通过错误率，因此需要高覆盖率，这使得1Gb的测序成本超过1000美元(参见例如Goodwin等，Nat.Rev.Genet.17:333
‑
351；2016)。
[0005]由于目前的大多数技术都提供每个单元短的核苷酸读出长度(40
‑
100个碱基长左右)，因此最具挑战性的问题之一在于将小的序列片段对齐成一个大的有意义的序列，并使用强大的超级计算机通过复杂的算法分析高覆盖率数据和生成的数据负载的后处理。新一代基于单分子的测序技术可以潜在地解决这个问题。然而，这些现有技术中的每一种都具
有高错误率，需要通常30X至100X左右的高覆盖率(同一序列区域的多次读出)才能获得可靠的数据。
[0006]因此，对于核酸测序的改进的方法，存在着需求。

技术实现思路

[0007]本文提供了对核酸模板进行测序的方法，所述方法包括：
[0008]提供测序混合物，其包含(i)聚合酶，(ii)待测序的模板核酸和与所述模板核酸的区段互补的引物寡核苷酸，和(iii)具有用于对生长中的核酸链进行模板指导的合成的组分的聚合酶试剂溶液，其中所述聚合酶试剂溶液包含用于再淬灭反应的组分和多种类型的淬灭的核苷酸类似物；其中每种类型的淬灭的核苷酸类似物具有标记的离去基团，所述标记的离去基团是能够被所述聚合酶切割的，并且每种类型的淬灭的核苷酸类似物具有不同的标记物，其中所述标记的离去基团在相应的核苷酸类似物与所述模板链的聚合酶依赖性结合后被切掉；
[0009]进行核酸合成，使得多个淬灭的核苷酸类似物被顺序添加到所述模板，由此：a)淬灭的核苷酸类似物与所述聚合酶结合，b)当所述淬灭的核苷酸类似物上的标记的离去基团被所述聚合酶切掉时，该核苷酸类似物被所述聚合酶掺入到所述模板链上，其中所述标记的离去基团在切掉后产生信号(例如发射光等)，然后c)通过再淬灭反应将所述核苷酸类似物上的标记的离去基团淬灭；以及
[0010]在核酸合成进行时检测来自于所述标记物的信号(例如光等)，并使用在步骤b)当所述标记的离去基团被切掉时与步骤c)所述标记的离去基团被淬灭之间的时间中检测到的信号(例如光等)来确定所述模板核酸的序列。
[0011]本专利技术的方法可用于各种不同的用途，包括基因组测序和SNP变体检测。
[0012]在一个实施方式中，所述公开的专利技术是基于在聚合酶顺序掺入dNTP时监测单独的聚合酶的单分子测序技术。在特定实施方式中，本专利技术涵盖了一种方法，其中每当聚合酶掺入与所述模板互补的淬灭的dNTP时，都在所述掺入过程中产生荧光信号(例如通过标记的离去基团、PPi等)。随后所述未淬灭的荧光信号被再淬灭。对于下一个淬灭的dNTP的掺入，重复所述过程(图1)。
[0013]更具体地，每当聚合酶向与所述模板DNA互补的链掺入淬灭的修饰的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)核苷酸类似物时，都产生对所述附连的核苷酸类型特异的荧光信号(例如通过标记的离去基团、PPi等)。存在5种类型的dNTP，即脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)和脱氧尿苷三磷酸(dUTP)。作为每个dNTP被聚合酶附连到互补链的结果，来自于淬灭的核苷酸(dNTP)的每个相应的离去基团在被外部光源连续激发后产生独特的荧光信号(例如红色、黄色、绿色或蓝色等)，所述光源的光谱与附连到末端磷酸酯的荧光团的激发光谱至少部分重叠。在所述淬灭的核苷酸类似物与先前附连的核苷酸类似物的3
’
组成部分的附连完成后，通过适合的信号(例如荧光、发光等)传感器和/或检测装置检测由所述离去基团产生的信号(例如荧光、发光等)，然后将它快速淬灭(图1)。
[0014]在特定实施方式中，测序通过检测每当淬灭的核苷酸被添加到互补链时产生的荧光来实现，所述荧光揭示了核苷酸的类型。因此，每个特定核苷酸的附连产生可以被荧光传
感器检测的荧光信号的短峰。结果产生了一个连续、顺序的颜色数据数组，其可以被转换成相应的核苷酸序列的数据数组(图1)。
[0015]本文还提供了淬灭的核苷酸，其包含选自下述的结构：图6
‑
11和表3中阐述的结构；以及dG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种对核酸模板进行测序的方法，所述方法包括：提供测序混合物，其包含(i)聚合酶，(ii)待测序的模板核酸和与所述模板核酸的区段互补的引物寡核苷酸，和(iii)聚合酶试剂溶液，所述聚合酶试剂溶液具有用于对生长中的核酸链进行模板指导的合成的组分，其中所述聚合酶试剂溶液包含用于再淬灭反应的组分和多种类型的淬灭的核苷酸类似物；其中每种类型的淬灭的核苷酸类似物具有标记的离去基团，所述标记的离去基团是能够被所述聚合酶切割的，并且每种类型的淬灭的核苷酸类似物具有不同的标记物，其中所述标记的离去基团在相应的核苷酸类似物与所述模板链的聚合酶依赖性结合后被切掉；进行核酸合成，使得多个淬灭的核苷酸类似物被顺序添加到所述模板，由此：a)淬灭的核苷酸类似物与所述聚合酶结合，b)当所述淬灭的核苷酸类似物上的标记的离去基团被所述聚合酶切掉时，所述淬灭的核苷酸类似物被所述聚合酶掺入到所述模板链上，其中所述标记的离去基团在切掉后产生信号，然后c)通过再淬灭反应将所述核苷酸类似物上的标记的离去基团再淬灭；以及在核酸合成进行时检测来自于所述标记物的信号，并使用在步骤b)当所述标记的离去基团被切掉时与步骤c)所述标记的离去基团被再淬灭之间的时间中检测到的信号来确定所述模板核酸的序列。2.权利要求1所述的方法，其中所述淬灭的核苷酸类似物已被附连到其上的荧光团修饰。3.权利要求1
‑
2所述的方法，其中所述淬灭的核苷酸类似物已被附连到末端磷酸酯的荧光团修饰。4.权利要求1
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3所述的方法，其中所述在切掉后产生的信号是通过外部光源的激发产生的光发射。5.权利要求1
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4所述的方法，其中所述离去基团是标记的焦磷酸盐。6.权利要求1
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5所述的方法，其中所述焦磷酸盐是用荧光团标记的。7.权利要求1
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6所述的方法，其中淬灭的核苷酸类似物的每种碱基用相对于其他碱基独特的荧光团标记。8.权利要求1
‑
7所述的方法，其中所述荧光团选自由表1中所列的荧光团组成的组。9.权利要求1
‑
8所述的方法，其中所述再淬灭反应使用淬灭酶或表面等离子体光子学。10.权利要求1
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9所述的方法，其中所述淬灭酶选自由ATP硫酸化酶、PPDK和AGP酶组成的组。11.权利要求1
‑
10所述的方法，其中再淬灭是利用所述ATP硫酸化酶通过APS上的淬灭剂分子被实现的。12.权利要求1
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10所述的方法，其中再淬灭是利用所述PPDK酶通过AMP上的淬灭剂分子被实现的。13.权利要求1
‑
10所述的方法，其中再淬灭是利用所述AGP酶通过ADP
‑
G上的淬灭剂分子被实现的。14.权利要求10
‑
13所述的方法，其中所述淬灭剂分子选自由表2中所列的淬灭剂组成的组，即，选自由DDQ
‑
I、Dabcyl、Eclipse、Iowa Black FQ、BHQ
‑
1、QSY
‑
7、BHQ
‑
2、DDQ
‑
II、Iowa Black RQ、QSY
‑
21和BHQ
‑
3组成的组。
15.权利要求1
‑
14所述的方法，其中所述聚合酶是DNA聚合酶。16.权利要求1
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15所述的方法，其中所述淬灭的核苷酸类似物的类型包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP和dUTP。17.权利要求1
‑
16所述的方法，其中所述再淬灭反应使用表面等离子体光子学。18.权利要求2
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17所述的方法，其中所述荧光团通过将不可移除的淬灭剂附连到所述核苷酸(dNTP)类似物来淬灭。19.权利要求1
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18所述的方法，其中所述不可移除的淬灭剂分子被附连到所述核苷酸类似物的核碱基或糖处。20.权利要求18
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19所述的方法，其中所述不可移除的淬灭剂分子选自由表2中所列的淬灭剂组成的组，，即，选自由DDQ
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I、Dabcyl、Eclipse、Iowa Black FQ、BHQ
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1、QSY
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7、BHQ
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2、DDQ
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II、Iowa Black RQ、QSY
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21和BHQ
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3组成的组。21.一种淬灭的核苷酸，其结构包含选自由图6
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图11或表3中所列的结构组成的组。22.一种淬灭的核苷酸，其包含选自下述组成的组的结构：dGTP
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【专利技术属性】
技术研发人员：埃南柯，
申请(专利权)人：萨摩尔股份有限公司，
类型：发明
国别省市：