香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法技术

本发明专利技术提供了一种香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法，以各处理组香蕉果皮的混合样品作为样品材料，香蕉基因组作为对照，进行两个独立生物学重复的DAP

【技术实现步骤摘要】
香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法。

技术介绍

[0002]越来越多的证据表明，通过结合基序分析工具和启动子结合测定方法，每个NAC转录因子可能具有特定且不同的结合基序。在植物生长和发育过程中，不同NAC转录因子可能通过响应不同的内部和外部信号而具有不同的特异性结合基序，为NAC转录因子调控的靶标基因提供了更多选择性。
[0003]ChIP
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Seq是将深度测序技术与ChIP实验相结合分析全基因组范围内DN A结合蛋白结合位点、组蛋白修饰、核小体定位或DNA甲基化的高通量方法。ChIP
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Seq检测方法具有高灵敏度、强灵活性、高分辨率等优点，已广泛应用在拟南芥等植物中用于深入说明植物转录调控机制。然而，ChIP
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Seq实验实施难度大，并依赖于抗体质量且对稀有或低表达蛋白具有高度选择性，并且受多种因素影响，包括染色质质量、DNA修饰以及与DNA结合的蛋白质的稳定性。因此，许多非模式植物物种因遗传背景差异大及抗体难制备等因素很难利用ChIP
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Seq技术深度分析转录因子蛋白在全基因组上的结合位点。
[0004]NAC转录因子MaNAC25和MaNAC28在香蕉果实耐冷性中起到负调控因子的作用，探究其响应不同信号的特异性结合基序具有重要意义。但香蕉富含糖、淀粉、维生素以及大量的蛋白质等营养物质，且组织内蛋白质分布在各个细胞器，彻底分离出核蛋白有一定的难度；并且香蕉果实作为呼吸跃变型果实，在常温下逐渐成熟，在低温下易发生冷害，且果肉和果皮成分存在差异，当内部组织响应外界不同的环境时而发生不同的变化，因此很难利用ChIP
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Seq技术检测香蕉果实内转录因子蛋白在全基因组上的结合位点。因此亟需开发一种香蕉果实MaNAC25和MaNAC28在全基因组上结合位点的鉴定方法，这对于研究NAC转录因子响应冷胁迫的转录调控机制具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种鉴定香蕉果实MaNAC25和MaNAC28在全基因组水平上的结合位点的方法，挖掘MaNAC25和MaNAC28响应冷胁迫时的特异性结合基序。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法，以各处理组香蕉果皮的混合样品作为样品材料，香蕉基因组作为对照，进行两个独立生物学重复的DAP
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Seq实验，鉴定MaNAC25和MaNAC28蛋白在香蕉全基因组水平上的结合位点。
[0007]进一步地，所述DAP
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Seq实验包括以下步骤：
[0008]S1、提取香蕉果皮的基因组DNA；
[0009]S2、将基因组DNA进行片段化处理和纯化处理后，测序构建基因组DNA文库；
[0010]S3、将冷响应转录因子的编码序列克隆到表达载体中构建融合蛋白，捕获表达的蛋白质；
[0011]S4、将蛋白质与衔接子连接的基因组DNA片段结合，重悬后进行PC R反应，纯化和筛选PCR产物并重悬，洗脱的DNA片段进行测序建库。
[0012]进一步地，所述鉴定方法包括步骤S5、将DAP
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Seq测序读段映射到香蕉基因组序列，检测相对于基因组对照的MaNAC25和MaNAC28的富集峰，分析MaNAC25和MaNAC28目标基因的富集基序。
[0013]进一步地，所述步骤S5具体包括：使用BOWTIE2将DAP
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Seq测序读段映射到香蕉基因组序列；使用MACS 2.0检测相对于基因组对照的MaN AC25和MaNAC28的富集峰，并用IGV进行富集峰可视化分析；使用Ho mer分析位于2.5kb以内转录起始位点上游或下游的DAP
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Seq峰的关联；使用BEDTools获得FASTA序列进行基序分析；使用MEME
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Chip Suite 5.0.5分析MaNAC25和MaNAC28目标基因的富集基序，以获得保守的基序序列图标和相应的评分值。
[0014]进一步地，所述鉴定方法包括步骤S6、以MaNAC25和MaNAC28在两个生物学重复实验中的重叠峰为分析对象，发现MaNAC25和MaNAC28与基因组各区域片段结合。
[0015]进一步地，所述步骤S6中基因组各区域片段包括启动子、3'
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非翻译区、5'
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非翻译区、外显子、内含子和其他基因间片段，MaNAC25和MaNAC28在香蕉全基因水平上的结合位点主要分布在启动子区域。
[0016]进一步地，所述鉴定方法包括步骤S7、进行基序富集分析，获得MaN AC25的DNA基序和MaNAC28的DNA基序。
[0017]进一步地，所述步骤S7具体包括：在已鉴定的MaNAC25和MaNAC28结合域的DNA基序中进行搜索，并利用MEME
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ChIP软件进行基序富集分析，获得MaNAC25的DNA基序和MaNAC28的DNA基序。
[0018]进一步地，所述步骤S7获得的MaNAC25的基序为[C/T]A[C/A]G[C/T/G][A/C/T][A/T]和[T/G/C]C[T/C/G][T/C][T/C][C/T]T[C/T][T/C][C/T]。
[0019]进一步地，所述步骤S7获得的MaNAC28的基序为CG[G/A/C]CG[G/A]C、C[T/G/A]CC[T/A/G]CC和CT[T/G]CTNC。
[0020]相对于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：
[0021]本专利技术基于DNA亲和纯化测序方法(DAP
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Seq)鉴定香蕉果实MaNA C25和MaNAC28在全基因组水平上的结合位点，该检测方法成本低且能够快速获取大量转录因子蛋白全基因组结合位点信息，同时可捕获影响体内结合的全基因组DNA特性，能够更准确地检测转录因子结合基序和结合位点。
[0022]本专利技术方法能够检测冷响应的MaNAC25和MaNAC28在香蕉全基因组上的结合位点，挖掘出MaNAC25和MaNAC28响应冷胁迫时的特异性结合基序；
[0023]本专利技术方法鉴定获得MaNAC25和MaNAC28在香蕉全基因组上的结合位点，为筛选和鉴定MaNAC25和MaNAC28靶标基因提供了重要信息，并为MaNAC25和MaNAC28响应冷胁迫的转录调控机制研究提供了重要依据。
附图说明
[0024]图1是本专利技术实验例提供的两个DAP
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Seq实验显示MaNAC25和MaN AC28的结合峰和
两个重复实验中的重叠峰图像；
[0025]图2是本专利技术实验例提供的MaNAC25和MaNAC28结合位点在注释基因的不同区域中的分布图；
[0026]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法，其特征在于，以各处理组香蕉果皮的混合样品作为样品材料，香蕉基因组作为对照，进行两个独立生物学重复的DAP
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Seq实验，鉴定MaNAC25和MaNAC28蛋白在香蕉全基因组水平上的结合位点。2.根据权利要求1所述的香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法，其特征在于，所述DAP
‑
Seq实验包括以下步骤：S1、提取香蕉果皮的基因组DNA；S2、将基因组DNA进行片段化处理和纯化处理后，测序构建基因组DNA文库；S3、将冷响应转录因子的编码序列克隆到表达载体中构建融合蛋白，捕获表达的蛋白质；S4、将蛋白质与衔接子连接的基因组DNA片段结合，重悬后进行PCR反应，纯化和筛选PCR产物并重悬，洗脱的DNA片段进行测序建库。3.根据权利要求1所述的香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法，其特征在于，包括步骤S5、将DAP
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Seq测序读段映射到香蕉基因组序列，检测相对于基因组对照的MaNAC25和MaNAC28的富集峰，分析MaNAC25和MaNAC28目标基因的富集基序。4.根据权利要求3所述的香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法，其特征在于，所述步骤S5具体包括：使用BOWTIE2将DAP
‑
Seq测序读段映射到香蕉基因组序列；使用MACS 2.0检测相对于基因组对照的MaNAC25和MaNAC28的富集峰，并用IGV进行富集峰可视化分析；使用Homer分析位于2.5kb以内转录起始位点上游或下游的DAP
‑
Seq峰的关联；使用BEDTools获得FASTA序列进行基序分析；使用MEME
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Chip Suite 5.0.5分析MaNAC25和MaNAC28目标基因的富集基序，以...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋春波，
申请(专利权)人：浙江万里学院，
类型：发明
国别省市：