一种精准测量NGF相对结合活性的检测方法技术

本发明专利技术涉及生物制药加工技术领域，具体为一种精准测量NGF相对结合活性的检测方法，所述检测方法至少包括如下步骤：提供96孔板的培养板；S1：接种TrkA抗原蛋白，在2

【技术实现步骤摘要】
一种精准测量NGF相对结合活性的检测方法


[0001]本专利技术涉及生物制药加工
，具体为一种精准测量NGF相对结合活性的检测方法。

技术介绍

[0002]神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是一种神经肽和神经营养因子，主要的作用是参与某些神经元的生长发育、分化、再生长和维持。在很多动物中可以得到，最早被发现于神经营养因子中，研究的最多最透彻，是一种具有促突起生长和神经元营养等多重生物学功能的一种神经细胞生长的调节因子，尤其是对中枢和周围神经元的功能性的表达有重要的调控作用。NGF由α、β、γ三个亚基单位组成，其中活性的关键区域是β亚基，一般由两个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体，和人源的NGF的结构相似，具有高度的同源性，而且生物效应种属间也没有特异性。
[0003]在营养神经方面，NGF在胚胎发育时期，为效应神经元生存所必须。NGF及其受体分布于中枢神经系统，海马和脑皮质产生的NGF可以通过胆碱能神经逆向运输到前脑基底核，维持胆碱能神经元的功能和存活。在保护神经方面，NGF的效应细胞神经元收到损伤时，比如药物损害、外伤，甚至缺氧、缺血等情况，神经元会发生一系列病理改变，可能导致死亡。这时，NGF会抑制上述损伤神经的作用，方式有：抑制超氧自由基的释放、抑制钙离子超载、抑制释放毒性氨基酸等。促进再生长方面，切断轴突后给与NGF会减少神经元的改变与死亡，提高了轴突再生的可能性。另外，它还会影响轴突再生的开始时间，参与再生神经元的数量以及质量，速度。NGF还可以影响免疫细胞活性，调节免疫系统功能，抑制肿瘤的分裂，促进肿瘤向良性分化，促进创口组织的修复和创口的愈合。因此测试NGF的结合活性有重要的意义。
[0004]现有的测试NGF结合活性的ELISA方法较少，只针对鼠源的NGF，且方法没有系统适应性，没有线性区间和上下平台，不适合科学研究和药品检测。另外一种就是用细胞测试生物学活性，这也是世界上最为常用的方法，和ELISA法相比需要额外的制作效应细胞，且重复性线性较差，对种属来源也有要求。
[0005]目前NGF活性蛋白主要是通过检测a2M的结合活性实验来验证，因为α2
‑
巨球蛋白(Alpha
‑2‑
Macroglobulin,简称a2M)是NGF的一个作用因子，因此通过酶联免疫吸附试验来检测a2M与NGF的相互作用；通过将NGF活性蛋白与a2M的结合活性来达到测试的目的，该测试方法包括：
[0006]1.重组NGF蛋白用PBS，含0.01％BSA(pH 7.4)稀释成不同的浓度；
[0007]2.取100μL加入到包被有人重组a2M的微孔板中，37℃条件下孵育2h；
[0008]3.用PBST洗板，以anti
‑
NGF多克隆抗体孵育1h，洗板3次；
[0009]4.以HRP标记的二抗孵育，洗板3次；
[0010]5.加入底物溶液，37℃孵育15
‑
25min；
[0011]6.加入终止液并在450nm波长下读数。

技术实现思路

[0012]本专利技术的目的在于提供一种精准测量NGF相对结合活性的检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0013]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种精准测量NGF相对结合活性的检测方法，所述检测方法至少包括如下步骤：提供96孔板的培养板；
[0014]S1：包被：在所述培养板上接种TrkA抗原蛋白，TrkA抗原蛋白需要在2
‑
8℃下过夜包被17
±
2h，这样可以使TrkA抗原蛋白紧密的结合在包被板上；
[0015]S2：洗板：清洗所述培养板，用洗板机将多余的TrkA抗原蛋白清洗出；
[0016]S3：封闭：将封闭液的密度以300uL/孔加入到反应用培养板上，并使用封板膜封培养板，将其放置在微孔板恒温振荡器中，经过25℃孵育2h后；
[0017]S4：洗板：清洗所述培养板，同步骤S2，用洗板机将多余的封闭液清洗出；
[0018]S5：NGF靶点蛋白样品孵育：稀释为不同浓度的定量的NGF靶点样品加至反应用培养板上，并使用封板膜封培养板，将其放置在微孔板恒温振荡器中，经过25℃孵育1h；
[0019]S6：洗板：清洗所述培养板，同步骤S2，用洗板机将多余的NGF靶点样品清洗出；
[0020]S7：酶标抗体孵育：将稀释好的酶标抗体溶液用移液器以100uL/孔加入到反应用培养板上，将其放置在微孔板恒温振荡器中，经过25℃孵育1h；
[0021]S8：洗板：清洗所述培养板，同步骤S2，用洗板机将多余的酶标抗体溶液清洗出；
[0022]S9：TMB显色：加入显色液100μL/孔，轻拍96孔板至混匀，并使用封板膜封培养板，室温避光孵育10
‑
20分钟；
[0023]S10：终止：加入1mol/L终止液以100uL/孔加入到反应用培养板上，终止反应；
[0024]S11：读板：将终止后的孔板置于酶标仪中，打开软件，振荡10s，以650nm为参比波长，读取并记录波长450nm下孔板的吸光度值OD 450nm/650nm，按照计算公式计算相对结合活性。
[0025]本专利技术涉及的仪器如表1.1所示、以及涉及的实验试剂与耗材如表1.2所示，可以采用特定厂家生产的特定型号的试剂进行实验认证，也可以通过能实现同等功能的其他仪器以及实验试剂与耗材进行验证，只要能按照特定的浓度配比，都可以实现我们所需要的效果。
[0026]仪器表1.1
[0027][0028][0029]实验试剂与耗材表1.2
[0030][0031]优选的，所述洗板的操作步骤包括：
[0032]取出培养板，用洗板机洗板，结束后在吸水纸上拍去残留液体；
[0033]其中,洗板用液体为通用试剂缓冲液；洗板机清洗次数为6次；每次选择300μL缓冲液清洗，每次清洗时间为2s；浸泡时间为10s,该清洗参数由洗板机机器控制。
[0034]优选的，所述通用试剂缓冲液包括0.05％PBST溶液，其配置方法包括：
[0035]称取N包PBS粉剂10Ng倒入烧杯中，一边加水，一边通过磁力搅拌器搅拌以充分溶解；
[0036]再使用移液器吸取0.5N mL Tween 20带入烧杯，并加水至NL，通过磁力搅拌器搅拌以充分溶解可获得浓度为0.05％的PBST溶液；
[0037]转入试剂瓶，贴好标签，2～8℃保存，有效期为3个月。
[0038]所述S3中所述封闭液包括3％BSA溶液，其配置方法包括：
[0039]称取BSA粉末3Ng，加入通用试剂缓冲液100NmL，搅拌以充分溶解，贴好标签，此试液需要现配现用。
[0040]优选的，所述S5中所述NGF靶点样品为100uL加至反应用培养板中，并使用封板膜封培养板，置于微孔板恒温振荡器中，25℃孵育1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种精准测量NGF相对结合活性的检测方法，其特征在于：所述检测方法至少包括如下步骤：提供96孔板的培养板；S1：包被：在所述培养板上接种TrkA抗原蛋白，TrkA抗原蛋白需要在2
‑
8℃下过夜包被17
±
2h，这样可以使TrkA抗原蛋白紧密的结合在包被板上；S2：洗板：清洗所述培养板，用洗板机将多余的TrkA抗原蛋白清洗出；其中,洗板用液体为通用试剂缓冲液；S3：封闭：将封闭液的密度以300uL/孔加入到反应用培养板上，并使用封板膜封培养板，将其放置在微孔板恒温振荡器中，经过25℃孵育2h后；S4：洗板：清洗所述培养板，同步骤S2，用洗板机将多余的封闭液清洗出；S5：NGF靶点蛋白样品孵育：稀释为不同浓度的定量的NGF靶点样品加至反应用培养板上，并使用封板膜封培养板，将其放置在微孔板恒温振荡器中，经过25℃孵育1h；S6：洗板：清洗所述培养板，同步骤S2，用洗板机将多余的NGF靶点样品清洗出；S7：酶标抗体孵育：将稀释好的酶标抗体溶液用移液器以100uL/孔加入到反应用培养板上，将其放置在微孔板恒温振荡器中，经过25℃孵育1h；S8：洗板：清洗所述培养板，同步骤S2，用洗板机将多余的酶标抗体溶液清洗出；S9：TMB显色：加入显色液100μL/孔，轻拍96孔板至混匀，并使用封板膜封培养板，室温避光孵育10
‑
20分钟；S10：终止：加入1mol/L终止液以100uL/孔加入到反应用培养板上，终止反应；S11：读板：将终止后的孔板置于酶标仪中，打开软件，振荡10s，以650nm为参比波长，读取并记录波长450nm下孔板的吸光度值OD 450nm/650nm，按照计算公式计算相对结合活性。2.根据权利要求1所述的一种精准测量NGF相对结合活性的检测方法，其特征在于：所述S1步骤中所述包板用的所述TrkA抗原蛋白的密度为5μg/mL。3.根据权利要求1所述的一种精准测量NGF相对结合活性的检测方法，其特征在于：所述S1步骤中所述包板用的所述TrkA抗原蛋白的密度为10μg/mL。4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋拓，韩肖雄，程蔚玲，高蓓蓓，王焘杰，李巍巍，
申请(专利权)人：白帆生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：