一种固氮菌富集和用纤维素培养固氮菌降解染料的方法技术

本发明专利技术公开了一种固氮菌富集和用纤维素培养固氮菌降解染料的方法。固氮菌的富集和用纤维素培养固氮菌降解染料的方法包括：1、采集土样作为接种源，利用培养基进行培养；2、将步骤1中的混菌接入含培养基的培养瓶中，通入氮气，在适宜的温度条件下培养，富集固氮菌；3、将步骤2中富集好的固氮菌离心收集，重悬于无碳源的培养基中以获得高浓度菌悬液；4、将步骤3中的菌悬液接种到含纤维素和染料的培养基中，确定培养基中糖、蛋白质和染料浓度的变化以及固氮菌的纤维素酶活性。本发明专利技术为固氮混菌处理染料(如偶氮染料甲基橙)废水提出了一种全新的技术路线，具有低成本、环保等优势，在废纸纤维素利用和染料降解方面的应用前景广阔。维素利用和染料降解方面的应用前景广阔。维素利用和染料降解方面的应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
一种固氮菌富集和用纤维素培养固氮菌降解染料的方法


[0001]本专利技术涉及微生物的富集培养方法，具体地说，涉及一种固氮菌富集和用纤维素培养固氮菌降解染料的方法。

技术介绍

[0002]据报道，2021年全国纸及纸板生产量12105万吨，较2020年增长7.50％。由于纸制品的质量规格以及废纸与其他废物混合，纸纤维回收为新纸非常困难，2021年国内废纸回收率为51.3％，废纸的利用率为54.1％。除回收利用外，其他如填埋、焚烧等废纸处理方式会释放有害物质，对环境造成二次污染，且经济效益较低。废纸再生纤维技术可以降低纤维生产成本，节省原料。但国内没有形成废纸回收产业，废纸回收质量参差不齐。多次的回收会造成纤维损耗和纤维素大分子间的结合强度的减弱。废纸厌氧消化可有效利用废纸资源，将其转化为各种有机酸、醇类和甲烷等。但因受较高碳氮比的限制需要与含氮量高的基质共消化，以提高其消化性能。固氮菌作为一种可以将氮气固定转化并利用的微生物，利用能够释放纤维素酶的固氮菌分解废纸是对抗高碳氮比的一种理想方法。
[0003]为了获得色彩鲜艳的彩色纸张，造纸工厂使用偶氮染料进行染色，会产生大量的染料废水。偶氮染料废水具有毒性，能引起DNA损伤和癌症，其排放对水生生物和人类具有危害。生物脱色是处理偶氮染料废水的环境友好技术，但高碳氮比的废水处理需要额外添加氮源。利用固氮菌处理废水，可以避免增加氮源，降低成本。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种固氮菌富集和用纤维素培养固氮菌降解染料的方法。
[0005]为了实现本专利技术目的，本专利技术提供一种固氮菌富集和用纤维素培养固氮菌降解染料的方法方法，包括以下步骤：
[0006](1)采集土样作为接种源，将土样悬浮于无菌水中混匀；将上述悬液取接入培养瓶中，加入培养基，使培养体系体积达到50mL，通入氮气后密封，在恒温培养箱中于30
‑
32℃振荡培养48
‑
72h；
[0007](2)取步骤(1)中的培养液2.5
‑
5mL加入新的培养瓶中，加入45
‑
47.5mL的培养基(总体系50mL)，通入氮气后密封，在恒温培养箱中于30
‑
32℃振荡培养；
[0008](3)培养48
‑
72h后，培养液离心，弃上清液，菌体重悬于新的50mL的培养基中，接入培养瓶，通入氮气后密封，于30
‑
32℃继续振荡培养；
[0009](4)重复步骤(3)10～15次；
[0010](5)取2.5
‑
5mL富集到的固氮菌培养液接入培养瓶中，培养瓶中加入45
‑
47.5mL的培养基(总体系50mL)，通入氮气后密封，于30
‑
32℃振荡培养20
‑
24h；
[0011](6)步骤(5)中的固氮菌培养液经离心，弃上清液，菌体重悬于无碳源的培养基中以获得高浓度菌悬液；上述高浓度菌悬液取5mL接入培养瓶中，加入无碳源培养基、纤维素材料和染料，最终培养瓶中培养液体积为50mL，通入氮气后密封，在恒温培养箱中30
‑
32℃
振荡培养；每天取样，测糖、蛋白质和染料浓度变化，连续1
‑
5天；第5天测固氮菌的纤维素酶(CMC酶)和β
‑
葡萄糖苷酶活性。
[0012]优选地，所述培养基中不含氮源。
[0013]所述培养基成分为KH2PO
4 2.3g/L,K2HPO
4 5.75g/L,MgSO4·
7H2O 0.025g/L,CaCl2·
2H2O 0.025g/L,葡萄糖10g/L,H3BO
3 0.124mg/L,FeSO4·
7H2O 0.1068mg/L,CoSO4·
7H2O 0.0512mg/L,CuSO4·
5H2O 0.0044mg/L,MnCl2·
4H2O 0.00384mg/L,Na2MoO4·
2H2O 0.1068mg/L,ZnSO4·
7H2O 0.0512mg/L。
[0014]步骤(6)中所述无碳源的培养基即将上述培养基中去除葡萄糖后的培养基。
[0015]优选地，步骤(4)能够富集出固氮细菌。
[0016]优选地，步骤(6)中高浓度菌悬液的OD
600
＝1.8
‑
2.0。
[0017]本专利技术中，所述纤维素材料为纸，优选卫生纸；所述染料为偶氮染料，优选甲基橙。卫生纸能被固氮菌利用，同时甲基橙可以被降解。
[0018]进一步地，步骤(6)卫生纸的终含量为1.8
‑
2g/L，甲基橙的终含量为20
‑
25mg/L。
[0019]优选地，通入氮气10
‑
15min后密封。
[0020]优选地，振荡培养转速为120
‑
130rpm。
[0021]优选地，离心条件为：7000
‑
8000rpm离心6
‑
10min。
[0022]优选地，步骤(1)～(6)中培养温度为30℃。
[0023]本专利技术为固氮混菌处理染料废水(如偶氮染料甲基橙)提出了一种全新的技术路线，具有低成本、环保等优势，在废纸纤维素利用和染料降解方面的应用前景广阔。
附图说明
[0024]图1为本专利技术较佳实施例中富集的固氮菌群属水平多样性(A)和温度对固氮菌生长的影响(B)。
[0025]图2为本专利技术较佳实施例中以卫生纸为碳源培养固氮菌过程中的糖(A)、蛋白质(B)含量变化和固氮菌的CMC酶活和β
‑
葡萄糖苷酶活(C)。
[0026]图3为本专利技术较佳实施例中以卫生纸为碳源培养固氮菌降解甲基橙过程中甲基橙的含量变化。
具体实施方式
[0027]为了解决甲基橙染料污染和废弃卫生纸问题，本专利技术提供一种利用卫生纸培养固氮混菌降解甲基橙的方法。
[0028]本专利技术采用如下技术方案：
[0029](1)取泥土作为接种源，将泥土悬浮于无菌水中，充分混匀；将上述悬液5mL接入血清瓶中，加入45mL培养基，通入氮气10min后用丁基橡胶塞和铝帽密封。在恒温培养箱中于30℃，120rpm培养72h。
[0030](2)将(1)中的培养液5mL加入新的血清瓶中，加入45mL培养基，通入氮气10min后用丁基橡胶塞和铝帽密封，在恒温培养箱中于30℃，120rpm培养。培养72h后培养液用离心机在8000rpm离心10min，弃去上清液，保留菌体；将上述菌体重新悬浮于新的50mL培养基中，接入血清瓶，通入氮气10min后用丁基橡胶塞和铝帽密封，于30℃继续振荡培养。上述步
骤重复10～15次。
[0031](3)取5mL富集到的固氮菌培养液接入120mL的血本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种固氮菌富集和用纤维素培养固氮菌降解染料的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集土样作为接种源，将土样悬浮于无菌水中混匀；将上述悬液接入培养瓶中，加入培养基，培养体系的体积为50mL，通入氮气后密封，在恒温培养箱中于30
‑
32℃振荡培养48
‑
72h；(2)取步骤(1)中的培养液2.5
‑
5mL加入新的培养瓶中，加入45
‑
47.5mL的培养基，通入氮气后密封，在恒温培养箱中于30
‑
32℃振荡培养；(3)培养48
‑
72h后，培养液离心，弃上清液，菌体重悬于新的50mL的培养基中，接入培养瓶，通入氮气后密封，于30
‑
32℃继续振荡培养；(4)重复步骤(3)10～15次；(5)取2.5
‑
5mL富集到的固氮菌培养液接入培养瓶中，培养瓶中加入45
‑
47.5mL的培养基，通入氮气后密封，于30
‑
32℃振荡培养20
‑
24h；(6)步骤(5)中的固氮菌培养液经离心，弃上清液，菌体重悬于无碳源的培养基中以获得高浓度菌悬液；上述高浓度菌悬液取5mL接入培养瓶中，加入无碳源培养基、纤维素材料和染料，最终培养瓶中培养液体积为50mL，通入氮气后密封，在恒温培养箱中30
‑
32℃振荡培养；每天取样，测糖、蛋白质和染料浓度变化，连续1
‑
5天；第5天测固氮菌的纤维素酶和β
‑
葡萄糖苷酶活性；优选地，所述培养基成分为KH2PO
4 2.3g/L,K2HPO
4 5.75g/L,MgSO4·

【专利技术属性】
技术研发人员：刘小强，张伟，樊霆，郭苏影，张鹏，徐文艳，马萌遥，鲁洪娟，张震，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：