耐冷耐盐脱氮菌分离驯化筛选方法及其应用技术

本发明专利技术公开了耐冷耐盐脱氮菌分离驯化筛选方法及其应用。该方法包括以下步骤：S1.采集的水样接种至异养硝化富集培养基中富集培养得菌液；S2.将步骤S1所得菌液转接至新的异养硝化富集培养基中进行驯化培养，驯化培养过程中通过多次转接逐步降低培养温度至15℃，提升盐度至4％；S3.将步骤S2所得菌液接种至反硝化培养基中好氧培养2～7d后，筛选出异养硝化

【技术实现步骤摘要】
耐冷耐盐脱氮菌分离驯化筛选方法及其应用


[0001]本专利技术涉及环境微生物及水处理
，具体涉及耐冷耐盐脱氮菌分离驯化筛选方法及其应用。

技术介绍

[0002]近年来随着海水养殖业的快速发展以及养殖密度的不断提高，海水养殖尾水的排放量不断增加，给周围环境带来了巨大负担。对海水养殖尾水进行处理是减少因海水养殖带来的生态环境污染的主要方法。人工湿地是目前应用较为广泛的一种水处理技术，它在污水处理的基础上同时具有经济和环境效益。
[0003]但是，由于海水盐度较高，且北方地区冬季寒冷，高盐和低温的环境会严重影响人工湿地系统的脱氮功能微生物的生长与繁殖，限制其生长速率及脱氮速率，使人工湿地对海水养殖业尾水的脱氮效果受到影响，导致人工湿地技术在海水养殖业尾水处理中的应用效果并不理想。

技术实现思路

[0004]针对现有技术不足，本专利技术要解决的技术问题是，提供耐冷耐盐脱氮菌分离驯化筛选方法及其应用，通过该分离驯化筛选方法可取得耐冷耐盐的脱氮菌，将其应用于人工湿地系统可提高在低温条件下人工湿地对海水养殖业尾水的脱氮效果。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术一方面公开了一种耐冷耐盐脱氮菌分离驯化筛选方法，包括以下步骤：
[0006]S1.采集的水样接种至异养硝化富集培养基中富集培养得菌液；
[0007]S2.将步骤S1所得菌液转接至新的异养硝化富集培养基中进行驯化培养，驯化培养过程中通过多次转接逐步降低培养温度至15℃，提升盐度至4％；
[0008]S3.将步骤S2所得菌液接种至反硝化培养基中好氧培养2～7d后，筛选出异养硝化
‑
好氧反硝化的菌株；
[0009]S4将步骤S3筛选出的不同菌株单独培养，测试筛选出脱氮效率最高的菌株即得目标的脱氮菌。
[0010]作为优选，所述步骤S1的培养温度为30℃，培养基盐度为1％，培养时间为2～7d；所述步骤S2包括：将步骤S1所得菌液转接至新的盐度2％的异养硝化富集培养基中，25℃下培养2～7d后，将所得菌液转接至新的盐度3％的异养硝化富集培养基中，20℃下培养2～7d后，将所得菌液转接至新的盐度4％的异养硝化富集培养基中，15℃下培养2～7d得驯化后的菌液。
[0011]作为优选，所述步骤S4的测试标准为所述脱氮菌能够在15℃和3％盐度条件下进行硝化和反硝化。
[0012]作为优选，所述脱氮菌在15℃条件下进行硝化和反硝化作用，36h内NH
4+
和NO3‑
的降解效率分别为41％和37％；在3％盐度条件下进行硝化和反硝化作用，36h内NH
4+
和NO3‑
的
降解效率分别为99％和95％。
[0013]作为优选，所述异养硝化富集培养基包括：NH4Cl 0.5g/L，K2HPO4·
3H2O 7.8g/L，CH3COONa
·
3H2O 7.4g/L，KH2PO
4 1.5g/L，MgSO4·
7H2O 0.1g/L，NaCl 10g/L，微量元素溶液3mL/L；所述异养硝化富集培养基的pH值为7.0～7.3。
[0014]作为优选，所述反硝化培养基包括：KNO
3 1.0g/L，K2HPO4·
3H2O 7.8g/L，CH3COONa
·
3H2O 7.45g/L，KH2PO
4 1.5g/L，MgSO4·
7H2O 0.1g/L，NaCl 10g/L，微量元素溶液3mL/L；所述异养硝化富集培养基的pH值为7.0～7.3。
[0015]作为优选，所述微量元素水溶液包括：MnSO
4 3g/L；ZnCl
2 1.42g/L；CaCl
2 0.6g/L；H3BO
3 1.12g/L；FeSO4·
7H2O 0.3g/L；CuSO
4 1.01g/L；所述步骤S1中，将5ml水样接种至100ml所述异养硝化富集培养基进行振荡培养，培养条件为30℃、180r
·
min
‑1培养7d。
[0016]作为优选，所述步骤S2中，采用加入NaCl的方式调整培养基的盐度。
[0017]作为优选，所述步骤S3包括：采用细菌DNA提取试剂盒提取筛选所得菌株的基因组DNA，利用16S rDNA基因通用引物1492R/27F引物对菌株DNA进行PCR扩增，对菌株的16S rDNA序列进行测定，将PCR产物序列送至派森诺测序，结果上传到NCBI数据库进行BLAST对比，利用MEGA 7.0软件以Neighbor
‑
joining法构建系统发育树，通过菌株的系统发育树进行菌株鉴定。
[0018]作为优选，所述步骤S1的水样采集自山东白浪河河口，所述步骤S4所得的脱氮菌为不动杆菌，其16S rDNA序列与NCBI登录号为NR 102814.1的耐盐不动杆菌Acinetobacter halotolerans的同源性达99.86％。
[0019]作为优选，所述步骤S4所得的脱氮菌的硝化作用和反硝化作用的最适条件均为：碳氮比(C/N)为15～20，pH＝7，温度为30℃。
[0020]本专利技术另一方面公开了一种上述的耐冷耐盐脱氮菌分离驯化筛选方法在强化人工湿地系统中的应用方法，将所述脱氮菌施加于人工湿地系统，以提高人工湿地系统在低温高盐度环境下的脱氮能力。
[0021]作为优选，所述人工湿地系统用于进行海水养殖尾水处理；将步骤S4所得的脱氮菌制成OD
600
＝1.0
±
0.05的菌液；所述人工湿地的进水端连接海水养殖池的出水端，所述人工湿地的出水端连接储水池的进水端，定期自所述人工湿地的进水端和出水端取样，检测尾水处理的脱氮效率，待测试结果稳定后，分别在第32d、42d、52d按2L/m2向人工湿地喷洒所述菌液以强化人工湿地。
[0022]作为优选，所述人工湿地包括上行池和下行池；所述上行池和下行池均由下往上依次为35cm厚的砾石层，20cm厚的炉渣层，以及10cm厚的细沙层；所述砾石层的砾石粒径为5～15cm，炉渣层的炉渣粒径为3～10cm，细沙层的细沙粒径为1～5mm；在人工湿地上方种植互花米草，种植密度为30株/m2。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：提供了耐冷耐盐脱氮菌分离驯化筛选方法及其应用方法，通过驯化可分离筛选到耐冷耐盐的脱氮菌，所得脱氮菌能够在15℃和4％盐度条件下进行硝化和反硝化，将其应用于人工湿地系统可提高在低温条件下人工湿地对海水养殖业尾水的脱氮效果。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种耐冷耐盐脱氮菌分离驯化筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.采集的水样接种至异养硝化富集培养基中富集培养得菌液；S2.将步骤S1所得菌液转接至新的异养硝化富集培养基中进行驯化培养，驯化培养过程中通过多次转接逐步降低培养温度至15℃，提升盐度至4％；S3.将步骤S2所得菌液接种至反硝化培养基中好氧培养2～7d后，筛选出异养硝化
‑
好氧反硝化的菌株；S4将步骤S3筛选出的不同菌株单独培养，测试筛选出脱氮效率最高的菌株即得目标的脱氮菌。2.根据权利要求1所述的耐冷耐盐脱氮菌分离驯化筛选方法，其特征在于，所述步骤S1的培养温度为30℃，培养基盐度为1％，培养时间为2～7d；所述步骤S2包括：将步骤S1所得菌液转接至新的盐度2％的异养硝化富集培养基中，25℃下培养2～7d后，将所得菌液转接至新的盐度3％的异养硝化富集培养基中，20℃下培养2～7d后，将所得菌液转接至新的盐度4％的异养硝化富集培养基中，15℃下培养2～7d得驯化后的菌液。3.根据权利要求1所述的耐冷耐盐脱氮菌分离驯化筛选方法，其特征在于，所述步骤S4的测试标准为所述脱氮菌能够在15℃和3％盐度条件下进行硝化和反硝化。4.根据权利要求3所述的耐冷耐盐脱氮菌分离驯化筛选方法，其特征在于，所述脱氮菌在15℃条件下进行硝化和反硝化作用，36h内NH
4+
和NO3‑
的降解效率分别为41％和37％；在3％盐度条件下进行硝化和反硝化作用，36h内NH
4+
和NO3‑
的降解效率分别为99％和95％。5.根据权利要求1所述的耐冷耐盐脱氮菌分离驯化筛选方法，其特征在于，所述异养硝化富集培养基包括：NH4Cl 0.5g/L，K2HPO4·
3H2O 7.8g/L，CH3COONa
·
3H2O 7.4g/L，KH2PO
4 1.5g/L，MgSO4·
7H2O 0.1g/L，NaCl 10g/L，微量元素溶液3mL/L；所述异养硝化富集培养基的pH值为7.0～7.3；所述反硝化培养基包括：KNO
3 1.00g/L，K2HPO4·
3H2O 7.8g/L，CH3COONa
·
3H2O 7.45g/L，KH2PO
4 1.5g/L，MgSO4·
7H2O 0.1g/L，NaCl 10g/L，微量元素溶液3mL/L；所述异养硝化富集培养基的pH...

【专利技术属性】
技术研发人员：李俊峰，李红芳，梁生康，崔正国，胡琳慧，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：