萝卜基因组特有single-locusIP标记的开发方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种萝卜基因组特有single

【技术实现步骤摘要】
萝卜基因组特有single
‑
locus IP标记的开发方法及应用


[0001]本专利技术涉及萝卜分子标记生物
，具体涉及一种萝卜基因组特有single
‑
locus IP标记的开发方法及应用。

技术介绍

[0002]萝卜属与芸薹(Brassica)属是十字花科中两个非常重要的近缘属。早在1924年Karpechenko就开始进行萝卜属和芸薹属作物之间的杂交试验，以创造新的物种或实现基因渐渗。迄今，萝卜中已有多个有益基因通过萝卜与芸薹属作物之间的远缘杂交而导入到芸薹属作物中，如Ougra
‑
CMS细胞质雄性不育基因与恢复基因、抗TuMV基因、抗甜菜根结线虫基因等。同时许多优异的萝卜
‑
芸薹属作物种间杂种后代也被应用于芸薹属作物实际育种工作中。如何准确鉴定与强化筛选萝卜
‑
芸薹种间杂交后代中的外源萝卜染色体片段至关重要，这是打破被改良作物不良基因连锁累赘的必要技术基础。
[0003]目前，仅利用芸薹属受体作物基因组信息所开发的分子标记，已无法满足萝卜
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芸薹种间杂交后代中萝卜外源片段的准确鉴定。

技术实现思路

[0004]本专利技术针对萝卜
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芸薹种间杂交后代中外源萝卜片段的鉴定困难的缺陷，提供一种萝卜基因组特有single
‑
locus IP标记的开发方法及应用，该方法利用生物信息学技术，在萝卜和芸薹属作物基因组信息基础上，开发萝卜特有single
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locus IP标记；并将这些标记实际应用于萝卜
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芸薹种间杂交后代萝卜外源导入片段的鉴定中。
[0005]为实现上述目的，本专利技术所涉及一种萝卜基因组特有single
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locus IP标记的开发方法，包括以下步骤：
[0006]1)萝卜基因组信息获取：获取多个萝卜品种的基因组信息；
[0007]2)引物设计：在Linux系统下，基于任意一种萝卜基因组注释信息与其对应的参考基因组序列信息，使用Perl语言编写脚本批量提取其所有基因内含子两侧外显子序列，生成Primer3.0所需格式文件；使用primer3_2.5.0软件批量设计引物；
[0008]3)电子PCR分析：执行e
‑
pcr程序(ePCR_2.3.9)将引物和其余的萝卜基因组数据库进行电子PCR分析，生成引物电子PCR分析结果；通过韦恩图(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)作图分析得到多个萝卜基因组共有单位点(single
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locus)扩增的多条IP标记引物；
[0009]4)萝卜特有single
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locus IP标记分析：利用上述多条IP标记引物，分别在甘蓝型油菜泛基因组，白菜，甘蓝，芥菜型油菜基因组进行e
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PCR分析，通过软件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/cgi
‑
bin/liste/Venn/calculate_venn.htpl)绘制韦恩图；对电子PCR结果进行反向选择，即舍弃预期在甘蓝型油菜，白菜，甘蓝与芥菜型油菜任一参考基因组中预期有扩增的萝卜single
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locus IP标记引物，最终仅保留在多个萝卜基因组中预期均扩增单一位点，同时不在甘蓝型油菜，白菜，甘蓝与芥菜型油菜任一参考基因组
中预期有PCR产物的标记位点，最终得到多条萝卜基因组特有single
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locus IP标记引物；
[0010]5)萝卜基因组特异single
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locus IP特异性验证：根据多条特有single
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locus IP标记引物扩增位点在萝卜基因组的分布情况，以物理间隔约为2Mb的原则，每条染色体上挑选25
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30对引物；进行实际PCR扩增和琼脂糖凝胶检测，判断上述标记在实际应用中的效果；检测所用材料为来自国内外的萝卜材料、甘蓝型油菜品种、白菜品种、甘蓝、芥菜；依据验证结果，共有多对single
‑
locusIP标记引物对为萝卜材料中特异扩增，而在油菜、白菜、甘蓝和芥菜中无扩增；以上多对single
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locusIP标记引物对即为可实际应用的一套萝卜特有single
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locus IP标记引物对组。
[0011]进一步地，所述步骤1)中，萝卜基因组信息来自4个萝卜品种，分别为Qing、Rsa10、Xin
‑
li
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mei和RS01。
[0012]上述4个萝卜品种的基因组序列下载地址分别为：
[0013]R10，http://39.100.233.196:82/download_genome/Brassica_Genome_data/Rsa10/；
[0014]Qing，https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA/902/824/885/GCA_902824885.1_Qing/；Xin
‑
li
‑
mei和RS01，https://ngdc.cncb.ac.cn/bioproject/browse/PRJCA003033。
[0015]再进一步地，所述步骤2)中，萝卜品种为Rsa10；设计引物参数设置为：
[0016]PRIMER_OPT_SIZE＝22，
[0017]PRIMER_MIN_SIZE＝18，
[0018]PRIMER_MAX_SIZE＝24，
[0019]PRIMER_PRODUCT_SIZE_RANGE＝80
‑
450。
[0020]再进一步地，所述步骤3)中，电子PCR分析参数设置为：
‑
n2
‑
g 1
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m 60，即允许左右引物各有2个错配，1个gap；
[0021]剩余萝卜品种为Qing、Xin
‑
li
‑
mei和RS01；IP标记引物的条数为58412条。
[0022]再进一步地，所述步骤4)中，萝卜基因组特有single
‑
locus IP标记引物条数为25448条
[0023]再进一步地，所述步骤5)中，single
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locus IP标记引物对有192对，具体如下：
[0024]萝卜基因组特有single
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locus IP标记信息
[0025][0026][0027][0028][0029][0030][0031][0032]本专利技术还提供了一种上述方法开发的萝卜特有single
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种萝卜基因组特有single
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locus IP标记的开发方法，其特征在于：包括以下步骤：1)萝卜基因组信息获取：获取多个萝卜品种的基因组信息；2)引物设计：在Linux系统下，基于任意一种萝卜基因组注释信息与其对应的参考基因组序列信息，使用Perl语言编写脚本批量提取其所有基因内含子两侧外显子序列，生成Primer3.0所需格式文件；使用primer3_2.5.0软件批量设计引物；3)电子PCR分析：执行e
‑
pcr程序将引物和其余的萝卜基因组数据库进行电子PCR分析，生成引物电子PCR分析结果；通过韦恩图作图分析得到多个萝卜基因组共有单位点扩增的多条IP标记引物；4)萝卜特有single
‑
locus IP标记分析：利用上述多条IP标记引物，分别在甘蓝型油菜泛基因组，白菜，甘蓝，芥菜型油菜基因组进行e
‑
PCR分析，通过软件绘制韦恩图；对电子PCR结果进行反向选择，即舍弃预期在甘蓝型油菜，白菜，甘蓝与芥菜型油菜任一参考基因组中预期有扩增的萝卜single
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locus IP标记引物，最终仅保留在多个萝卜基因组中预期均扩增单一位点，同时不在甘蓝型油菜，白菜，甘蓝与芥菜型油菜任一参考基因组中预期有PCR产物的标记位点，最终得到多条萝卜基因组特有single
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locus IP标记引物；5)萝卜基因组特异single
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locus IP特异性验证：根据多条特有single
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locus IP标记引物扩增位点在萝卜基因组的分布情况，以物理间隔约为2Mb的原则，每条染色体上挑选25
‑
30对引物；进行实际PCR扩增和琼脂糖凝胶检测，判断上述标记在实际应用中的效果；检测所用材料为来自国内外的萝卜材料、甘蓝型油菜品种、白菜品种、甘蓝、芥菜；依据验证结果，共有多对single
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locusIP标记引物对为萝卜材料中特异扩增，而在油菜、白菜、甘蓝和芥菜中无扩增；以上多对single
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locusIP标记引物对即为可实际应用的一套萝卜特有single
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locus IP标记引物对组。2.根据权利要求1所述萝卜基因组特有single
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locus IP标记的开发方法，其特征在于：所述步骤1)中，萝卜基因组信息来自4个萝卜品种，分别为Qing、Rsa10、Xin
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li
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mei和RS01。3.根据权利要求1所述萝卜基因组特有single
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locus IP标记的开发方法，其特征在于：所述步骤2)中，萝卜品种为Rsa10；设计引物参数设置为：PRIMER_OPT_SIZE＝22，PRIMER_MIN_SIZE＝18，PRIMER_MAX_SIZE＝24，PRIMER_PRODUCT_SIZE_RANGE＝80
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450。4.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：俎峰，李霞，何晓莹，管培丽，周永明，李根泽，范楚川，张云云，罗延青，赵凯琴，原小燕，
申请(专利权)人：云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所华中农业大学，
类型：发明
国别省市：