一种水解制备(+)γ-内酰胺的方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，公开了一种水解制备(+)γ

【技术实现步骤摘要】
一种水解制备(+)
γ
‑
内酰胺的方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及一种水解制备(+)γ
‑
内酰胺的方法，具体涉及一种微生物不对称水解制备(+)γ
‑
内酰胺的方法。

技术介绍

[0002]γ
‑
内酰胺酶是酰胺酶的一种，由于其能选择性降解工业上的(
±
)γ
‑
内酰胺，因而被命名为γ
‑
内酰胺酶。(
±
)γ
‑
内酰胺则是一种可以合成数十种药物的医药中间体，如治疗艾滋病的阿巴卡韦以及治疗甲型流感的帕拉米韦。γ
‑
内酰胺市场需求巨大，但(
±
)γ
‑
内酰胺自身却是外消旋体，包含(
±
)两种旋光构型：(+)γ
‑
内酰胺以及(
‑
)γ
‑
内酰胺。临床上已知阿巴卡韦的药理活性来源于(
‑
)阿巴卡韦，因而科学工作者们的目光都锁定在了挖掘(+)γ
‑
内酰胺酶上，试图利用(+)γ
‑
内酰胺酶拆分(
±
)γ
‑
内酰胺，从而得到光学纯的(
‑
)γ
‑
内酰胺以满足生产需要。但实际上(+)γ
‑
内酰胺也可以通过溴化作用实现构型翻转，因而(+)γ
‑
内酰胺在工业应用上同样具有价值。
[0003]目前制备单构型γ
‑
内酰胺的方法主要有不对称合成法和外消旋体拆分法，外消旋拆分法又包括循环优先结晶法和生物不对称拆分法。不对称合成法是创造一个不对称的反应条件或环境，使反应按一定的方向进行，从而使两个对映体中的一个占优势的合成方法，但这种方法效果很差。循环优先结晶法操作太过繁琐，不适合工业化生产，且存在产率低等问题。

技术实现思路

[0004]生物法具有反应条件温和，效率高，立体选择性高，环境友好，利于工业放大等等优点。本专利技术的目的在于提供一种水解制备(+)γ
‑
内酰胺的方法，通过调控优化微生物产酶、对酶液进行浓缩，转化过程中采取抑菌措施，进而能高效、安全的降解(
±
)γ
‑
内酰胺生产(+)γ
‑
内酰胺产品。
[0005]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]一种水解制备(+)γ
‑
内酰胺的方法，包括以下步骤：
[0007]步骤一、微生物发酵产(
‑
)γ
‑
内酰胺酶
[0008]选产(
‑
)γ
‑
内酰胺酶的菌株作为种子，经28℃、150r/min培养得种子液，再以体积分数2.0％～8.0％接种量接入装有产酶发酵培养基的发酵罐，装液量15％～35％，培养温度25℃～32℃，转速为110～180rpm，通气量1vvm～3vvm，初始pH5.0～9.0，发酵20～60h后收集发酵液；
[0009]步骤二、粗酶液的获得
[0010]将步骤一获得的发酵液低温高速离心，分离菌体，收集菌体，得到的湿菌体经磷酸钠缓冲液洗涤3次，将菌体悬于磷酸钠缓冲液中，进行细胞破碎，破碎后10000rpm离心，取上清液为粗酶液，低温储存，备用；
[0011]步骤三、酶液浓缩
[0012]将步骤二所得的(
‑
)γ
‑
内酰胺酶粗酶液，低温透析浓缩得到浓缩酶液，浓缩时使用10kD离心超滤管；测粗酶液和浓缩酶液酶活，计算回收率；
[0013]步骤四、生产(
‑
)γ
‑
内酰胺
[0014]利用步骤三中获得的浓缩酶液无菌转化(
±
)γ
‑
内酰胺；其中，转化体系的温度为24℃～35℃，搅拌速度为150rpm，转化24～60h，并向转化体系中加入抗生素，得到的(
‑
)γ
‑
内酰胺用液相法检测浓度。
[0015]优选地，步骤一中所述经28℃、150r/min培养的培养基包括酵母膏5g/L，葡萄糖5g/L，KH2PO47g/L，Na2HPO42g/L，MgSO40.4g/L，FeSO40.02g/L，CaCl20.02g/L，NH4Cl 5g/L，调节pH7.0。
[0016]优选地，步骤一所述产酶发酵培养基为葡萄糖4g/L，蛋白胨10g/L，Tween
‑
801g/L，KH2PO47g/L，Na2HPO41.5g/L，Mg2SO40.4g/L，pH7.5。
[0017]优选地，所述的产(
‑
)γ
‑
内酰胺酶的菌株为嗜冷杆菌，购自中国菌种保藏中心，编号为Bio
‑
091077。
[0018]优选地，步骤二中所述低温高速离心的条件具体为4℃，12000rpm。
[0019]优选地，步骤二中所述磷酸钠缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7.0。
[0020]优选地，步骤三中所述浓缩温度为4℃，浓缩条件为10000r/min离心30min。
[0021]优选地，步骤四中加入的抗生素占转化体系体积分数的0.1％～0.2％。
[0022]优选地，步骤四中所述的抗生素为卡纳或四环素。
[0023]酶活测定方法：将洗涤后的菌体悬浮于浓度为10g/L的N
‑
乙酰
‑
L
‑
苯丙氨酸的pH 7.0的0.05mol/L磷酸盐缓冲液中，温度28℃、摇床转速150rpm条件下反应30min，在反应初速度线性范围内。10000rpm离心10min，取上清液。上清液经正丁醇萃取后，再经有机滤膜过滤制成上样样品，每组实验平行3次。手性HPLC分析检测转化后样品中(
±
)γ
‑
内酰胺的浓度，并计算每升发酵液的酶活(U/L)。
[0024]酶活定义：在28℃下，每分钟水解1μmol(+)γ
‑
内酰胺所需要的酶量定义为一个酶活单位(U)。
[0025]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0026](1)利用超滤管及透析袋浓缩(
‑
)γ
‑
内酰胺酶液，较传统浓缩酶液的方法具有操作简单，成本低，高酶活回收率的优势。超滤管浓缩酶液节约时间，且能重复利用。
[0027](2)采用高浓度酶液生产(+)γ
‑
内酰胺效率高，快速，大大降低了生产成本。
[0028](3)采用向转化体系中加入适量抗生素，可有效地防止染菌，降低了安全隐患。
[0029](4)转化体系经过实验优化，转化效率高。
附图说明
[0030]图1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水解制备(+)γ
‑
内酰胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、微生物发酵产(
‑
)γ
‑
内酰胺酶选产(
‑
)γ
‑
内酰胺酶的菌株作为种子，经28℃、150r/min培养得种子液，再以体积分数2.0％～8.0％接种量接入装有产酶发酵培养基的发酵罐，装液量15％～35％，培养温度25℃～32℃，转速为110～180rpm，通气量1vvm～3vvm，初始pH5.0～9.0，发酵20～60h后收集发酵液；步骤二、粗酶液的获得将步骤一获得的发酵液低温高速离心，分离菌体，收集菌体，得到的湿菌体经磷酸钠缓冲液洗涤3次，将菌体悬于磷酸钠缓冲液中，进行细胞破碎，破碎后10000rpm离心，取上清液为粗酶液，低温储存，备用；步骤三、酶液浓缩将步骤二所得的(
‑
)γ
‑
内酰胺酶粗酶液，低温透析浓缩得到浓缩酶液，浓缩时使用10kD离心超滤管；测粗酶液和浓缩酶液酶活，计算回收率；步骤四、生产(
‑
)γ
‑
内酰胺利用步骤三中获得的浓缩酶液无菌转化(
±
)γ
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内酰胺；其中，转化体系的温度为24℃～35℃，搅拌速度为150rpm，转化24～60h，并向转化体系中加入抗生素，得到的(
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)γ
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内酰胺用液相法检测浓度。2.如权利要求1所述的一种水解制备(+)γ
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内酰胺的方法，其特征在于，步骤一中所述经28℃、150r/min培养的培养基包括酵母膏5g/L，葡萄糖5g/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：迟乃玉，刘春莹，王倩倩，张庆芳，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：