一种基于金纳米粒子聚集检测目标HPV基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于金纳米粒子聚集检测目标HPV基因的方法，包括制备金纳米粒子溶液、制备亲和素溶液，取5μL目标HPV的DNA杂化反应溶液或目标HPV基因的PCR反应溶液，加入到60μL金纳米粒子溶液中混合；再向混合液中添加5μL亲和素溶液，并在25℃下反应20分钟后，依据金纳米粒子溶液颜色变化直接判断是否含有目标HPV基因。与现有技术相比，本发明专利技术以亲和素首次被用作聚集剂引发金纳米粒子聚集，通过肉眼观察颜色变化即可检测出HPV基因，避免了使用大量盐类物质达到使金纳米粒子聚集的目的；与其他方法相比，此检测方法具有相对灵敏(足以检测PCR产品)、操作简单、检测快(整个检测过程不超过两小时包括样品制备)、经济实惠(不需昂贵检测仪器)等优点。(不需昂贵检测仪器)等优点。(不需昂贵检测仪器)等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于金纳米粒子聚集检测目标HPV基因的方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学和核酸化学领域，特别是一种基于金纳米粒子聚集检测目标HPV基因的方法。

技术介绍

[0002]一般来讲，检测病毒基因的方法主要有两种，一种是直接检测方法，比如Hybrid Capture 2体系，以抗体捕获、核酸杂交和化学发光信号放大技术为基础的第二代杂交捕获(HC2)法。另一种是以PCR为基础的检测方法，由于HPV各型之间的基因存在较大的变异，多数采用位于HPV基因组相对保守的L1片断的简并引物扩增后，PCR产物经过电泳、杂交等检测方法确定HPV的存在和感染HPV的型别。目前常用的简并引物包括GP5+/6+、MY11/09、SPF10、PG2MY09/11、PGMY等，采用上述简并引物结合反向线形杂交进行HPV分型检测。
[0003]随着对HPV基因检测方法的不断探索，提供灵敏度和易用性的替代方法已被广泛研究。主要是对传统方法进行改进，便携式方法的研发，以及开发比色、荧光、有或无磁分离的电化学生物传感器等。其中，现有的HPV DNA特异性纳米生物传感器的构建是目前研究热点之一。根据文献报道，这种纳米生物传感器包含金纳米颗粒修饰的磁性纳米粒子(AuMNPs)，其表面修饰与E6 HPV
‑
16癌基因DNA序列互补的寡核苷酸。在成功地与变性病毒DNA杂交后进行磁分离，接着使用含有特定的抗双链DNA抗体(通过合成的HWRGWVC肽连接物(简称HWR)以定点方式连接到CdTe量子点)的CdTe量子点进行检测。
>[0004]尽管这些方法具有良好的重现性或者灵敏度，但是，有的方法使用到了抗体和核酸杂交等对检测设备要求高,试剂检测费用较贵，检测的选择性和灵敏度不高。有的方法需要昂贵的检测体系，成本高，操作繁琐，需要训练有素的人员。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种基于金纳米粒子聚集检测目标HPV基因的方法。
[0006]为达到上述目的，本专利技术是按照以下技术方案实施的：
[0007]一种基于金纳米粒子聚集检测目标HPV基因的方法，包括以下步骤：
[0008]S1、制备金纳米粒子溶液：取粒径为5
‑
20nm的金纳米粒子均匀分散到水中制得浓度为1
×
10
‑9mol/L的金纳米粒子溶液；
[0009]S2、制备亲和素溶液：取亲和素溶于PBS缓冲溶液中制得浓度为50
‑
100μg/mL的亲和素溶液；
[0010]S3、取5μL目标HPV基因的PCR反应溶液，加入到60μL金纳米粒子溶液中混合；再向混合液中添加5μL亲和素溶液，并在25℃下反应20分钟后，依据金纳米粒子溶液颜色变化直接判断是否含有目标HPV基因。
[0011]优选地，所述金纳米粒子的粒径为20nm。
[0012]优选地，所述亲和素溶液浓度为50
‑
100μg/mL。
[0013]优选地，所述PBS缓冲溶液的浓度为25μg/mL。
[0014]与现有技术相比，本专利技术以亲和素作为凝聚剂引发金纳米粒子(表面未经修饰)聚集，亲和素首次被用作聚集剂引发金纳米粒子聚集，通过肉眼观察颜色变化即可检测出HPV基因，避免了使用大量盐类物质达到使金纳米粒子聚集的目的；与其他方法相比，此检测方法具有相对灵敏(足以检测PCR产品)、操作简单、检测快(整个检测过程不超过两小时包括样品制备)、经济实惠(不需昂贵检测仪器)等优点。
附图说明
[0015]图1为不同浓度亲和素的金纳米粒子溶液颜色变化。
[0016]图2为金纳米粒子溶液的TEM图：(a)目标分子存在(b)目标分子不存在。
[0017]图3为本专利技术的方法原理示意图。
[0018]图4为本专利技术的方法的检测选择性的测试结果。
[0019]图5为本专利技术的方法的检测灵敏度的测试结果。
[0020]图6为本专利技术的方法检测细胞样品中目标基因的检测结果。
具体实施方式
[0021]为使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本专利技术，并不用于限定专利技术。
[0022]实施例1
[0023]首先，本实施例验证金纳米粒子溶液与不同浓度亲和素的反应
[0024]取50μL金纳米粒子溶液(10nm，1
×
10
‑9mol/L)分别与5μL不同浓度(5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL、500μg/mL)的亲和素溶液(溶解于浓度为25μg/mL的PBS缓冲溶液)反应，随着亲和素浓度的逐渐增大，相应金纳米粒子溶液的颜色发生了明显的变化，其颜色变化如图1所示。
[0025]根据图1的金纳米粒子溶液的颜色的变化可知：当亲和素溶液浓度为50μg/mL和100μg/mL时，相应金纳米粒子溶液颜色变化最为显著，呈现紫色。当亲和素溶液浓度低于50μg/mL时，随亲和素浓度的增大，相应金纳米粒子溶液颜色逐渐加深，即由红色转向粉色、粉紫色等。当亲和素溶液浓度高于50μg/mL时，随亲和素浓度增大，相应金纳米粒子溶液颜色主要呈现紫色。金纳米粒子溶液颜色发生变化，说明溶液中纳米粒子的存在状态发生了变化，即溶液颜色不同，粒子聚集程度不同。亲和素溶液浓度为50μg/mL和100μg/mL时，相应比值较大说明此时金纳米粒子间呈现较大程度的聚集；当亲和素溶液浓度低于50μg/mL时，随亲和素溶液浓度的增大其吸收比值逐渐增大，说明金纳米粒子间聚集程度增大，也说明金纳米粒子间聚集主要受吸附于其表面的亲和素浓度影响；当亲和素溶液浓度高于这个浓度时，随亲和素浓度的增大其吸收比值变化不明显，说明金纳米粒子间聚集已经达到饱和，增大亲和素浓度，对纳米粒子的聚集程度影响较小。因此，后续实施例中使用浓度为50μg/mL亲和素溶液。
[0026]实施例2
[0027]分别取5、10、20nm的金纳米粒子溶液若干分别与浓度为50μg/mL的亲和素溶液反应，相同浓度的亲和素溶液引发不同尺寸的金纳米粒子聚集，达到相似程度的聚集程度所
需时间不同，即不同尺寸的纳米粒子聚集速率不同。要达到相似程度的聚集，5、10、20nm的金纳米粒子分别需要60、45、30min。此结果充分显示对于相同浓度不同粒子尺寸的金纳米粒子溶液，在有限的空间内，大尺寸的纳米粒子间由于较小的相对距离，通过有效碰撞克服粒子间的排斥力更有利，更易聚集。因此，后续实施例中使用粒径为20nm的金纳米粒子溶液。
[0028]实施例3
[0029]目标HPV的DNA分子的检测
[0030]目标HPV的双链DNA分子通过探测HPV的单链DNA与目标HPV的单链DNA间的杂化(50℃，PBS(SDS 0.2wt％))获得。具体方法步骤如下：10μL探测单链DNA(0.5μM，PBS)与10本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于金纳米粒子聚集检测目标HPV基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、制备金纳米粒子溶液：取粒径为5
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20nm的金纳米粒子均匀分散到水中制得浓度为1
×
10
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9mol/L的金纳米粒子溶液；S2、制备亲和素溶液：取亲和素溶于PBS缓冲溶液中制得浓度为50
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100μg/mL的亲和素溶液；S3、取5μL目标HPV基因的PCR反应溶液，加入到60μL金纳米粒子溶液中混合；再向混合液中添...

【专利技术属性】
技术研发人员：朴晶玉，车明洙，金艳花，
申请(专利权)人：延边大学，
类型：发明
国别省市：