一种用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针、其制备方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针、其制备方法及试剂盒，属于马铃薯病毒检测技术领域。为解决现有核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒时使用的探针产量低、成本高的问题，本发明专利技术提供了一种用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术探针只在反向引物5

【技术实现步骤摘要】
一种用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针、其制备方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于马铃薯病毒检测
，尤其涉及一种用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针、其制备方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]马铃薯A病毒PVA是一种重要的马铃薯检疫性病害，目前主要的检测方法包括RT
‑
PCR技术、ELASA法、核酸斑点杂交法等。其中核酸斑点杂交是检测马铃薯病毒的一种重要方法，具有操作简单易掌握、检测灵敏度较高，易于推广等优点。探针是核酸斑点杂交的核心，现阶段应用的方法中探针产量低、成本高，一次反应产生约20μL探针，试剂成本约1600元。而且因现有探针中含有dUTP，易被RNA酶降解，引起其保存条件要求较高，长期保存需在
‑
20℃以下。同时，受成本影响，每次检测探针用量极少，约1μL探针检测100个反应，造成杂交反应池中探针浓度较低，造成检测灵敏度低。因探针用量太少，大多用于大量样品检测，在少量样品检测时会造成探针成本增加，因此现有探针还存在应用场景不灵活等缺点。

技术实现思路

[0003]为解决现有核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒时使用的探针产量低、成本高的问题，本专利技术提供了一种用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针、其制备方法及试剂盒。
[0004]本专利技术的技术方案：
[0005]一种用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0006]一种本专利技术中用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针的制备方法，以马铃薯A病毒反转录得到的cDNA为模板，以正向引物PVA
‑
F和反向引物PVA
‑
R为引物进行非对称PCR扩增，所得167bp扩增产物即为检测马铃薯A病毒的探针；
[0007]所述正向引物PVA
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0008]所述反向引物PVA
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0009]进一步的，所述反向引物PVA
‑
R的5
’
端标记地高辛。
[0010]进一步的，所述非对称PCR扩增的反应体系为：PVA阳性样品DNA 1.0μL，浓度为10uM的正向引物PVA
‑
F 0.1μL、浓度为10uM的反向引物PVA
‑
R 0.5μL，10
×
PCR Buffer2.5μL，浓度为2.5mM的dNTPMixture 2.0μL，浓度为5U/μL的Taq酶0.3μL和ddH2O17.2μL；
[0011]进一步的，所述非对称PCR的扩增程度为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸30s，30次循环，72℃终延伸7min，4℃保温。
[0012]一种用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的试剂盒，含有本专利技术中的用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针。
[0013]进一步的，还含有抗体液、洗液I、洗液II、洗涤缓冲液、核酸提取缓冲液、检测缓冲
液、氯仿、杂交液、阻断液、显色反应缓冲液、NBT、BCIP和正电荷尼龙膜方格。
[0014]进一步的，所述抗体液含有抗地高辛AP酶。
[0015]进一步的，所述洗液I含有如下浓度的组分：2
×
SSC，0.1％SDS；所述洗液II含有如下浓度的组分：1
×
SSC，0.1％SDS；所述洗涤缓冲液含有如下浓度的组分：0.1M马来酸，0.3％Tween
‑
20。
[0016]进一步的，所述提取缓冲液含有如下浓度的组分：1M NaCl、20mM MgCl2、0.5M醋酸钠和3％SDS；所述检测缓冲液含有如下浓度的组分：0.1M Tris
‑
HCl，0.1M NaCl。
[0017]一种使用本专利技术中的用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针进行马铃薯A病毒检测的方法，具体步骤如下：
[0018]步骤一、核酸提取：
[0019]取马铃薯样品按质量体积比与提取缓冲液混合、研磨，将研磨所得混合体系置于37℃条件下完成孵育，加入氯仿旋涡震荡使其充分混合，离心所得上清液即为核酸溶液，4℃保存备用；
[0020]步骤二、点样固定核酸：
[0021]取步骤一所得核酸溶液点样于正电荷尼龙膜的方格中，室温干燥后进行紫外交联固定核酸；
[0022]步骤三、杂交：
[0023]杂交液预热熔化后加入权利要求1所述用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针，混匀后将步骤二完成核酸固定的正电荷尼龙膜置于杂交液中，杂交过夜；
[0024]步骤四、洗膜：
[0025]取出步骤三中完成杂交的正电荷尼龙膜，依次用洗液I、洗液II和洗涤缓冲液进行洗涤；
[0026]步骤五、阻断：
[0027]配制1
×
阻断液和抗体液，将步骤四洗涤后的正电荷尼龙膜依次置于1
×
阻断液和抗体液中进行孵育；将完成孵育的正电荷尼龙膜置于洗涤缓冲液中洗涤，再置于检测缓冲液中平衡；
[0028]步骤六、显色：
[0029]将显色反应缓冲液、NBT和BCIP混匀后均匀涂在步骤五所得正电荷尼龙膜上，避光孵育显色，出现显色则表明待测马铃薯样本中存在马铃薯A病毒，显色越深则马铃薯A病毒阳性样本浓度越高。
[0030]进一步的，步骤一所述马铃薯样品与提取缓冲液的质量体积比为0.1g:150μL，所述提取缓冲液含有如下浓度的组分：1MNaCl、20mM MgCl2、0.5M醋酸钠和3％SDS；所述37℃孵育的时间为15min；所述离心为1000rpm离心10min。
[0031]进一步的，步骤二所述点样为2μL核酸溶液点样于正电荷尼龙膜上的一个方格中；所述紫外交联固定是在1200J条件下，将正电荷尼龙膜的正反面各交联1min。
[0032]进一步的，步骤三所述杂交液的预热温度为68℃；所述用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针与杂交液的体积比为10μL:5mL；所述杂交过夜的条件为68℃，8～15rpm。
[0033]进一步的，步骤四所述洗液I含有如下浓度的组分：2
×
SSC，0.1％SDS，所述洗液I
洗涤是用20mL洗液I在室温下洗涤2次，每次15min；所述洗液II含有如下浓度的组分：1
×
SSC，0.1％SDS，所述洗液II洗涤是用20mL50℃预热的洗液II在55℃下洗涤2次，每次15min；所述洗涤缓冲液含有如下浓度的组分：0.1M马来酸，0.3％Tween
‑
20，所述洗涤缓冲液洗涤是用20mL洗涤缓冲液洗涤5min。
[0034]进一步的，步骤五所述1
×
阻断液的配制方法为用0.1M马来酸缓冲液将预热熔化的10<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.一种权利要求1所述用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针的制备方法，其特征在于，以马铃薯A病毒反转录得到的cDNA为模板，以正向引物PVA
‑
F和反向引物PVA
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R为引物进行非对称PCR扩增，所得167bp扩增产物即为检测马铃薯A病毒的探针；所述正向引物PVA
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述反向引物PVA
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R的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。3.根据权利要求2所述一种用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针的制备方法，其特征在于，所述反向引物PVA
‑
R的5
’
端标记地高辛。4.根据权利要求2或3所述一种用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针的制备方法，其特征在于，所述非对称PCR扩增的反应体系为：PVA阳性样品DNA 1.0μL，浓度为10uM的正向引物PVA
‑
F 0.1μL、浓度为10uM的反向引物PVA
‑
R 0.5μL，10
×
PCR Buffer 2.5μL，浓度为2.5mM的dNTP Mixture 2.0μL，浓度为5U/μL的Taq酶0.3μL和ddH2O 17.2μL。5.根据权利要求4所述一种用于核酸斑点杂交法...

【专利技术属性】
技术研发人员：白艳菊，王腾，张威，刘尚武，黄元炬，马爽，
申请(专利权)人：黑龙江省农业科学院经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：