一种B细胞清除治疗后外周血B细胞亚群绝对计数的抗体组合、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种B细胞清除治疗后外周血B细胞亚群绝对计数的抗体组合、试剂盒及其应用，属于外周血B细胞亚群绝对计数技术领域。本发明专利技术首次采用单平台双管法，先采用组1抗体对病人外周血TBNK进行绝对计数，评估个体的整体免疫状态，较双平台法(以血球仪计数淋巴细胞绝对值)提高了准确度。如果治疗后个体组1抗体检测B细胞绝对计数＜0.1个/μl，则没有必要进行组2的处理和分析，减少了患者的经济负担，节约了工作时间；若治疗后个体组1抗体检测B细胞绝对计数≥0.1个/μl，则采用组2抗体进行B细胞亚群的绝对计数，能够获得准确的B细胞亚群计数结果，进而能够准确的对B细胞清除治疗后个体的预后进行风险评估。个体的预后进行风险评估。

【技术实现步骤摘要】
一种B细胞清除治疗后外周血B细胞亚群绝对计数的抗体组合、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于外周血B细胞亚群绝对计数
，尤其涉及一种B细胞清除治疗后外周血B细胞亚群绝对计数的抗体组合、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]人体正常免疫的维持依赖体液免疫和细胞免疫，多种免疫细胞参与复杂的免疫调控网络，尤其是淋巴细胞。作为反映细胞免疫水平的关键指标，通过多色流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群及其精细分型为机体免疫状态评估、免疫治疗或移植后免疫重建监测等方面提供重要信息。目前临床常规使用单克隆抗标记淋巴细胞检测TBNK亚群。随着对机体生理、病理状态下免疫细胞亚群及功能的进一步深入研究，常规TBNK亚群检测已不能满足临床需求，因此对淋巴细胞的精细分型也应用越来越广泛。
[0003]CD20分子是一种在B细胞表面表达的非糖基化蛋白，编码11号染色体上的MS4A1基因。CD20在B细胞分化发育成熟过程中，主要由前B细胞开始表达，初始B细胞增殖活化至浆细胞的过程CD20表达下调，在终末分化的浆母细胞和浆细胞中失去表达。CD20在B细胞的表达具有特异性，且在单核细胞及粒细胞、大部分T细胞系和其他组织细胞不表达。因此，通常认为CD20为B细胞的抗原标志物。B细胞靶向药物均可通过阻断向浆细胞分化发育的关键通路，以降低产生自身免疫性抗体的浆细胞水平，同时保留了B前体、幼稚B细胞和长寿浆细胞的再生库。目前以CD20单抗治疗(MoAbs)为代表的B细胞清除药物已被广泛应用于多种自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化(MS)、重症肌无力(MG)、自身免疫性脑炎(AE)、膜性肾病(MN)、免疫介导的周围神经病、血管炎等等。
[0004]尽管CD20单抗等B细胞靶向药物在自身免疫病治疗中显示出不错的疗效，但仍存在一定比例的治疗无应答现象，临床实践中需要评估B细胞靶向治疗效果并精准优化治疗方案。有研究表明在开始B细胞靶向治疗前，不同患者浆母细胞水平可能存在差别，研究发现这些差别可以用来解释和预测患者对于CD20单抗治疗的不同应答情况，这一观点在类风湿性关节炎与SLE患者均得到证实。研究表明抗CD20单抗诱导的深度B细胞消耗期后，记忆B细胞和浆母细胞的再生被认为与复发或治疗耐药性相关。另一方面，记忆B细胞的长期消耗和Naive B细胞的再次出现被认为是一些自身免疫性疾病具有临床反应的迹象。目前临床常规使用CD19+B细胞监测治疗效果，但常规监测无法探讨B细胞众多亚型及复杂功能如浆母细胞、记忆B细胞、纯真B细胞、双阴性B细胞等，从而遗漏了众多信息。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种B细胞清除治疗后外周血B细胞亚群绝对计数的抗体组合、试剂盒及其应用，能够准确的对B细胞清除治疗后外周血B细胞亚群进行绝对计数，具有高灵敏度。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种B细胞清除治疗后外周血B细胞亚群绝对计数的抗体组合，所述抗体组合包括两组抗体，组1抗体由CD3
‑
FITC、CD16
‑
PE、CD56
‑
PE、CD19
‑
APC、CD45
‑
PerCP
‑
Cy5.5、CD4
‑
PE
‑
Cy7、CD8
‑
APC
‑
Cy7和CD14
‑
BV421组成，组2抗体由CD45
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V500、CD38
‑
APC、CD14
‑
FITC、CD3
‑
FITC、CD20
‑
APC
‑
Cy7、CD27
‑
PerCP
‑
Cy5.5、CD19
‑
PE
‑
Cy7、IgG
‑
PE、IgM
‑
BV421和IgD
‑
R718组成。
[0008]本专利技术还提供了上述抗体组合在制备B细胞清除治疗后外周血B细胞亚群绝对计数试剂盒中的应用，
[0009]本专利技术还提供了上述抗体组合在制备B细胞清除治疗后个体预后风险评估产品中的应用。
[0010]优选的，所述B细胞清除治疗的方法包括CD20单克隆抗体治疗。
[0011]本专利技术还提供了一种B细胞清除治疗后外周血B细胞亚群绝对计数试剂盒，包括上述抗体组合、Fixable Viability Stain 520和溶血素。
[0012]本专利技术还提供了一种B细胞清除治疗后外周血B细胞亚群绝对计数的方法，包括如下步骤：采用上述组1抗体对外周血中的B细胞进行绝对计数，若检测结果为B细胞绝对计数＜0.1个/μl，则无需采用上述组2抗体进行B细胞亚群绝对计数，若检测结果为B细胞绝对计数≥0.1个/μl，则采用上述组2抗体进行B细胞亚群绝对计数。
[0013]优选的，采用上述组2抗体进行B细胞亚群绝对计数时，收集外周血中CD45+细胞为100万个以上。
[0014]优选的，采用上述组2抗体进行B细胞亚群绝对计数时，在外周血中加入Fixable Viability Stain 520。
[0015]优选的，所述B细胞亚群包括非转化记忆B细胞、转化记忆B细胞、纯真B细胞、双阴性B细胞和浆母细胞。
[0016]优选的，采用上述组2抗体对外周血中的B细胞亚群进行绝对计数时，采用的外周血为溶血后的外周血。
[0017]本专利技术的有益效果：
[0018]在靶向B细胞清除治疗后，个体外周血B细胞亚群的百分比和绝对数极低，所以对B细胞清除治疗后外周血B细胞亚群进行绝对计数是十分困难的，对于灵敏度的要求是很高的。本专利技术为了成功解决上述技术问题，首次采用单平台双管法，先采用组1抗体对病人外周血TBNK进行绝对计数，评估个体的整体免疫状态，较双平台法(以血球仪计数淋巴细胞绝对值)提高了准确度。如果治疗后个体组1抗体检测B细胞绝对计数＜0.1个/μl，则没有必要进行组2的处理和分析，减少了患者的经济负担，节约了工作时间；若治疗后个体组1抗体检测B细胞绝对计数≥0.1个/μl，则采用组2抗体进行B细胞亚群的绝对计数，能够获得准确的B细胞亚群计数结果，进而能够准确的对B细胞清除治疗后个体的预后进行风险评估。
附图说明
[0019]图1和图2为采用本专利技术方法对1例正常体检人进行外周血B细胞亚群绝对计数分析的结果，其中图1为组1抗体检测结果，图2为组2抗体检测结果；
[0020]图3和图4为采用本专利技术方法对1例膜性肾病患者使用抗CD20单克隆抗体治疗前外周血中B细胞亚群进行绝对计数的结果，其中图3为组1抗体检测结果，图4为组2抗体检测结
果；
[0021]图5和图6为采用本专利技术方法对1例膜性肾病患者使用抗CD20单克隆抗体治疗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种B细胞清除治疗后外周血B细胞亚群绝对计数的抗体组合，其特征在于，所述抗体组合包括两组抗体，组1抗体由CD3
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FITC、CD16
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PE、CD56
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PE、CD19
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APC、CD45
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PerCP
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Cy5.5、CD4
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PE
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Cy7、CD8
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APC
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Cy7和CD14
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BV421组成，组2抗体由CD45
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V500、CD38
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APC、CD14
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FITC、CD3
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FITC、CD20
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APC
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Cy7、CD27
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PerCP
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Cy5.5、CD19
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PE
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Cy7、IgG
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PE、IgM
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BV421和IgD
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R718组成。2.权利要求1所述抗体组合在制备B细胞清除治疗后外周血B细胞亚群绝对计数试剂盒中...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷莹，邹健，毛威，陈涵枝，杨振坤，吴国荣，王春新，
申请(专利权)人：无锡市人民医院，
类型：发明
国别省市：