SCFV蛋白的应用、CAR基因表达载体、CAR-T细胞及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种SCFV蛋白在制备CAR基因表达载体中的应用，其中，蛋白序列如SEQIDNO.1所示；其中，第1～21个氨基酸为胞外信号肽氨基酸序列；第22～31个氨基酸为Flag氨基酸序列；剩余序列为CXCR4scfv序列；还公开SCFV蛋白的基因序列在制备CAR基因表达载体中的应用，其中，所述基因序列如SEQIDNO.2所示；还公开了一种CAR基因表达载体和CAR

【技术实现步骤摘要】
SCFV蛋白的应用、CAR基因表达载体、CAR
‑
T细胞及应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，更具体地说是涉及重组蛋白、CAR基因表达载体、CAR
‑
T细胞及应用。

技术介绍

[0002]肺癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤，研究发现其受体CXCR4在促成肿瘤器官的特异性转移中发挥着重要的作用，CXCR4是肿瘤细胞穿透细胞外基质、脱离原发部位、侵袭入肿瘤周围组织的重要因子，并能促进造血干祖细胞的迁徙和归巢，CXCR4在正常肺组织中表达较低，但在肺癌中的表达较高。嵌合抗原受体修饰T细胞(Chimeric antigen receptor modified T cells,CAR
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T cells)疗法是发展最为迅速的一种过继性细胞免疫治疗疗法是发展最为迅速的一种过继性细胞免疫治疗，该技术中嵌合抗原受体(CAR，也称为嵌合T细胞受体)是被设计以在宿主T细胞表达，并且诱导针对肺癌CXCR4抗原合成构建体，从而靶向肺癌细胞表面抗原CXCR4，以介导抗肿瘤作用。
[0003]研究发现肺癌组织CXCR4的表达与患者年龄、性别等无相关性，而与分化程度、TNM分期、病理类型和淋巴结转移有相关性，肺癌的早期症状不典型、缺少有效的检测手段，很多病人就诊时已发生转移，错过了最好的手术时间，而放疗、化疗等治疗手段在病人选择方面存在一定的局限性。因此寻找新的肺癌的治疗靶点十分重要
[0004]因此，如何提供一种嵌合抗原受体的重组蛋白，并以其制备CAR基因表达载体和CAR
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T细胞是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术将SCFV蛋白编码基因与慢病毒载体连接，构建CAR基因表达载体，进而将CAR基因整合到T细胞中，使得SCFV蛋白编码基因转录翻译，并在T细胞表面表达，成为嵌合抗原受体CAR，达到靶向对抗CXCR4抗原的效果。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]SCFV蛋白在制备CAR基因表达载体中的应用，其中，蛋白序列如SEQ ID NO.1所示；其中，第1～21个氨基酸为胞外信号肽氨基酸序列；第22～31个氨基酸为Flag氨基酸序列；剩余序列为CXCR4 scfv序列。
[0008]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护一种编码所述的SCFV蛋白的基因序列在制备CAR基因表达载体中的应用，其中，所述基因序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护一种CAR基因表达载体，所述载体为plent
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EF1a
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Flag
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CXCR4 CAR。
[0010]作为上述技术方案优选的技术方案，plent
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EF1a为通过plent
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EF1a
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EGFP载体经AsisI、MIuI酶切后的慢病毒载体，Flag
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CXCR4 CAR为在SSEQ ID NO.2所示序列的基础上，经过AsisI、MIuI酶切后获得的重组质粒。
[0011]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护一种CAR基因表达载体
的构建方法，过程包括：将含有CXCR4 CAR的载体、慢病毒载体plent
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EF1a
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EGFP分别进行酶切，将酶切产物在22℃下连接2h，纯化回收，得CAR基因表达载体。
[0012]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护一种促进CAR基因表达载体的重组细胞，由plent
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EF1a
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Flag
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CXCR4 CAR重组质粒、PMD2G质粒、PSPAX2质粒转化至HEK293T细胞中而成。
[0013]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护一种CAR
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T细胞，由plent
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EF1a
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Flag
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CXCR4 CAR感染T细胞而成。
[0014]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护所述的重组蛋白在制备靶向治疗高表达CXCR4肿瘤细胞药物中的应用。
[0015]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护所述的CAR基因表达载体在制备靶向治疗高表达CXCR4肿瘤细胞药物中的应用。
[0016]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护所述的CAR
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T细胞在制备靶向治疗高表达CXCR4肿瘤细胞药物中的应用。
[0017]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开SCFV蛋白应用于制备CAR基因表达载体中，进而侵染T细胞，转录翻译得到CAR蛋白，CAR蛋白可与肿瘤细胞表面的CACR4抗原特异性结合，提高了肿瘤细胞的靶向治疗效果。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0019]图1附图为本专利技术CAR基因表达载体plent
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EF1a
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Flag
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CXCR4 CA图谱；
[0020]图2附图为凝胶电泳图；
[0021]图3附图为流式结果图；
[0022]图4附图为流式结果图；
[0023]图5附图为流式结果图；
[0024]图6附图为流式结果图；
[0025]图7附图为流式结果图。
具体实施方式
[0026]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0027]实施例1plent
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EF1a
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Flag
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CXCR4 CAR质粒构建
[0028]1、序列合成
[0029]全基因合成CXCR4 ScFv序列，N端添加CD8a信号肽和Flag序列，利用AsisI、MluI酶切位点克隆到慢病毒表达质粒plent
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EF1a
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EGFP上，该质粒为Amp抗性。
[0030]SCFV序列如下：
[0031]GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGAAGATCTCTGAGACTGAGCTGCACAGCCTCCGGCTTT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.SCFV蛋白在制备CAR基因表达载体中的应用，其中，蛋白序列如SEQ ID NO.1所示；其中，第1～21个氨基酸为胞外信号肽氨基酸序列；第22～31个氨基酸为Flag氨基酸序列；剩余序列为CXCR4 scfv序列。2.一种编码权利要求1所述的SCFV蛋白的基因序列在制备CAR基因表达载体中的应用，其中，所述基因序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种CAR基因表达载体，其特征在于，所述表达载体为plent
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EF1a
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Flag
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CXCR4 CAR。4.根据权利要求3所述的一种CAR基因表达载体，其特征在于，plent
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EF1a为通过plent
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EF1a
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EGFP载体经AsisI、MIuI酶切后的慢病毒载体，Flag
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CXCR4 CAR为在SSEQ ID NO.2所示序列的基础上，经过AsisI、MIuI酶切后获得的重组质粒。5.一种CAR基因表达载体的构建方法，其特征在于，过程...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈龙，杨发科，陈富坤，牛华涛，濮永祝，李进丹，杨聪慧，陈东雪，
申请(专利权)人：陈龙，
类型：发明
国别省市：