一种酶抑制型金纳米比色传感器定量检测黄曲霉素的方法技术

本发明专利技术公开了一种酶抑制型金纳米比色传感器定量检测黄曲霉素的方法，属于黄曲霉素检测技术领域。本发明专利技术以金纳米粒子作为探针，基于该材料构建了一种简单、灵敏的比色传感器用于检测黄曲霉素。通过表征和优化实验，结果表明构建的该传感器具有良好的选择性和功能性，可以成功地用于黄曲霉素的定量检测。该黄曲霉素的检测方法的线性范围是0.05～10μg/mL，检测限为0.03μg/mL。与传统的方法相比，本实验不需要复杂的仪器设备，研究方法快速便捷、易于操作和观察，得到了比较好的结果反馈。得到了比较好的结果反馈。得到了比较好的结果反馈。

【技术实现步骤摘要】
一种酶抑制型金纳米比色传感器定量检测黄曲霉素的方法


[0001]本专利技术属于黄曲霉素检测
，具体涉及一种酶抑制型金纳米比色传感器定量检测黄曲霉素的方法。

技术介绍

[0002]黄曲霉素(Aflatoxins，AFs)的主要类型有B1、G1、B2和G2。由霉菌自然产生的大概有13种，另外是从动物、微生物和人类产生的有毒代谢衍生物中产生的。在这些化合物中AFM1非常重要，需要大力关注，以遏制其在乳制品中的流行。同时，其他衍生物也很普遍，因为它们可以迅速转化为有效的AFB1，并可以成为合成其他有效真菌毒素的中间体。每年，世界上相当一部分农作物(特别是玉米)和油籽供应将受到AFs污染。它不仅对经济而且对人类健康造成很大的负面影响。在这些类型中，AFB1主要存在于食物样本中，研究发现它是最有效的天然致癌物质。黄曲霉素B1(AFB1)是这些化合物中最有效的，已经被很好地描述为是导致人和动物肝细胞癌(HCC)的发生因素之一。
[0003]黄曲霉素广泛存在于土壤中，而癌症患病率不断上升的重要因素之一也是因为食品中黄曲霉素含量超标。黄曲霉素含量太高的食品会被完全丢弃，这导致了农业行业的巨额年度亏损。而其对人们生活健康带来的危害也已经引起了社会的广泛关注。黄曲霉素的一个很大的副作用是对人类免疫系统的影响。黄曲霉素AFB1会影响人类的器官和某些系统，例如肺部免疫系统，这些都会导致人类存在不同的健康问题。有多项研究都证明了黄曲霉素对免疫系统具有负面影响。黄曲霉素污染事件层出不穷。食品安全与人体健康越来越受到各类相关部门的重视，其作为一种重要的真菌毒素，是世界范围内各种食品的天然污染物。
[0004]目前，在仪器分析技术中，检测AFB1常用的方法是仪器分析方法，其中常规分析方法有以下几种：
[0005]薄层分析法，是一种快速、实用的定量和半定量测定各种底物中黄曲霉素的方法，该方法是黄曲霉素最经典的测定方法，在早期检测中最常见，是国家标准方法之一。对于黄曲霉素有很多的检测方法，中外检测机构仍采用该方法进行检测。TLC方法的主要优点是可以微量、快速、简单的分析样品。这种方法的可靠性在很大程度上取决于操作员的经验。
[0006]高效液相色谱具有高分离能力、非常灵敏、使用方便、易于自动化、重现性良好，可与不同检测器联用等优点。
[0007]酶联免疫吸附分析(ELISA)层析方法需要昂贵的仪器和在层析领域的专业知识。酶联免疫吸附试验作为检测黄曲霉素的传感器是另一种实用的黄曲霉素检验方式。该试验是一种快速而灵敏的食品常规分析技术，只需极少的样品清理。该方法适用于快速、灵敏、样品吞吐量高、进样量要求低的分析。虽然ELISA法的检测限低于用于黄曲霉素检测的仪器技术，但会影响结果。因此，如果样品中含有复杂的基质，那么与TLC和HPLC法相比，ELISA法就不那么可靠了。
[0008]但这些方法有的高灵敏度，但仪器贵；有的具有良好重现性，但样品处理繁琐，极
大地限制了AFB1的快速检测和现场筛选。

技术实现思路

[0009]本专利技术针对现有技术中存在的问题，本专利技术以金纳米粒子作为探针，基于该材料构建了一种简单、灵敏的比色传感器用于检测黄曲霉素。
[0010]为实现上述技术目的，本专利技术所采用的技术方案为：
[0011]一种酶抑制型金纳米比色传感器定量检测黄曲霉素的方法，包括以下步骤：
[0012](1)金纳米溶液AuNPs的制备：配置150mL 1mmol/L的HAuCl4溶液，置于容器中，加热，并持续搅拌，在溶液即将到达沸点时，加入15mL 10mg/mL的柠檬酸钠溶液，目的是消除AuNPs之间的静电作用，使得AuNPs分散良好；持续搅拌加热，使得混合液处于沸腾状态，直至溶液由淡黄色变为深酒红色停止加热，持续搅拌降至室温，抽滤，得到金纳米溶液AuNPs；
[0013](2)纯化碘化硫代乙酰胆碱：称取0.5mmol碘化硫代乙酰胆碱ATI溶解于5mL纯净的蒸馏水中，加入0.6mM AgNO3，溶液会立即产生大量的AgI沉淀，再加入1.0mL
[0014]0.2mol
·
L
‑1的NaCl，然后通过高速离心除去沉淀，得到硫代乙酰胆碱ATCh，并将硫代乙酰胆碱ATCh配置为5μmol/L、pH为7.0的PBS缓冲溶液后使用；
[0015](3)检测样品中黄曲霉素含量：先将步骤(1)制备好的金纳米溶液AuNPs稀释5倍得到稀释液；取3.6mL稀释液，加入40μL乙酰胆碱酯酶，再依次加入0.4mL待测样品溶液，最后加入0.1mL步骤(2)所得硫代乙酰胆碱缓冲溶液，将混合后的溶液放在室温下进行反应；最后在分光光度计上测量522nm处的吸收光谱并记录数据，再根据标准曲线计算样品中黄曲霉素的含量。
[0016]进一步的，步骤(1)在使用各类器皿前，首先要冲洗干净所需仪器。清洗前，先用王水浸泡一段时间，在流动的水流中冲洗干净，然后使用数控超声波清洗器将其洗净，最后用蒸馏水进行多次冲洗直至不会聚成水滴后，放入烘箱中待用。
[0017]进一步的，步骤(1)过滤时使用一次性针管进行抽滤，所使用的过滤膜为孔径为0.45μm的水性膜。
[0018]进一步的，步骤(2)离心转速为13000rpm。
[0019]进一步的，步骤(3)乙酰胆碱酯酶的酶浓度为2500mU/mL
[0020]进一步的，步骤(3)进行实际检测时，试验在相同条件下重复三次，取平均值，以提升检测准确度。
[0021]纳米材料由以纳米为单位的颗粒组成，其直径在1
‑
100nm之间。其具有较为优良的性能，在生物医药、生物工程等研究领域都扮演了重要的角色。
[0022]金纳米材料具有以下几处优点，例如尺寸与光学性质有关、易于制备和偶联、比表面积大、稳定性和生物兼容性等，已成为最受欢迎的光学传感NMS。金纳米粒子在可见光区具有很强的SPR吸收，这在很大程度上是由于其表面电子与入射电磁辐射共振的集体振荡。
[0023]AuNPs可以很容易地被识别元件修饰，包括烷基硫化物、谷胱甘肽、硫代化DNA/RNA以及硫代化肽和蛋白质。其中特别的基于DNA/RNA的识别元件用于功能化Au NMS是适配子，主要是因为它们对分析物具有特异性和稳定性。
[0024]本专利技术检测方法的检测原理为：
[0025]黄曲霉素AFs对乙酰胆碱酯酶AChE存在一定的抑制和阻碍作用。
[0026]原理为：由于硫代乙酰胆碱ATCh带正电荷，将其作为乙酰胆碱酯酶AChE的基底物质，金纳米材料作为探针，由于静电引力的作用，ATCh会吸附在带负电的金纳米材料表面。ATCh被乙酰胆碱酯酶催化水解成为硫代胆碱，硫代胆碱表面有正电荷，且有一个巯基(
‑
SH)在硫代胆碱表面。Au
‑
SH键是起决定作用的，它在金纳米粒子和巯基之间形成，因此，AuNPs的表面会使得硫代胆碱结合上去，这样由于静电引力作用和AuNPs和
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶抑制型金纳米比色传感器定量检测黄曲霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)金纳米溶液AuNPs的制备：配置150mL 1mmol/L的HAuCl4溶液，置于容器中，加热，并持续搅拌，在溶液即将到达沸点时，加入15ml 10mg/mL的柠檬酸钠溶液，持续搅拌加热，使得混合液处于沸腾状态，直至溶液由淡黄色变为深酒红色停止加热，持续搅拌降至室温，过0.45μm的滤膜，得到金纳米溶液AuNPs；(2)纯化碘化硫代乙酰胆碱：称取0.5mmol碘化硫代乙酰胆碱ATI溶解于5mL纯净的蒸馏水中，加入0.6mM AgNO3，溶液会立即产生大量的AgI沉淀，再加入1.0mL 0.2mol.L
‑1的NaCl，然后通过高速离心除去沉淀，得到硫代乙酰胆碱ATCh，并将硫代乙酰胆碱ATCh配置为5μmol/L、pH为7.0的PBS缓冲溶液后使用；(3)检测样品中...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋兴良，陈配财，胡雪萍，徐源霞，曹晋瑜，
申请(专利权)人：临沂大学，
类型：发明
国别省市：