一种穿梭质粒、构建方法及应用技术

本申请涉及质粒技术领域，尤其涉及一种穿梭质粒、构建方法及应用。该穿梭质粒以pEZ15Asp为基础质粒，对其进行改造，通过对其复制子进行替换后，该穿梭质粒具有如SEQID NO.26～29任一所示的核苷酸序列所示。该穿梭质粒可以在运动发酵单胞菌和大肠杆菌中穿梭，第一复制起始区具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，第二复制起始区具有SEQ IDNO.3～8任一所示的核苷酸序列。其电转入得到的运动发酵单胞菌转化子，在稳定传代30代后生长速率无显著下降，并可与内源性质粒长期兼容，说明穿梭质粒的传代稳定性强，十分适合于构建重组菌株，进行运动发酵单胞菌代谢工程及基因功能的研究和应用。研究和应用。研究和应用。

【技术实现步骤摘要】
NO.3～8任一所示的核苷酸序列。
[0008]第三方面，本申请实施例公开了一种穿梭质粒，其具有如SEQ ID NO.24或25所示的核苷酸序列，所述穿梭质粒可以在运动发酵单胞菌和大肠杆菌中穿梭，所述穿梭质粒具有在大肠杆菌中的第一复制起始区和在运动发酵单胞菌中的第二复制起始区，所述第一复制起始区具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.3或4所示的核苷酸序列。
[0009]第四方面，本申请实施例公开了一种穿梭质粒，其具有如SEQ ID NO.26～29任一所示的核苷酸序列，所述穿梭质粒可以在运动发酵单胞菌和大肠杆菌中穿梭，所述穿梭质粒具有在大肠杆菌中的第一复制起始区和在运动发酵单胞菌中的第二复制起始区，所述第一复制起始区具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.5～8任一所示的核苷酸序列。
[0010]第五方面，本申请实施例公开了第三方面所述的穿梭质粒的应用，所述应用包括如下至少一项：
[0011](I)构建表达异丁醇代谢途径的重组载体及重组微生物；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种穿梭质粒的构建方法，包括：获得基础质粒，所述基础质粒具有在大肠杆菌中的第一复制起始区和运动发酵单胞菌中的第三复制起始区；所述第一复制起始区具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述第三复制起始区具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；将第二复制起始区替代所述第三复制区，以得到所述穿梭质粒；所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.3～8所示的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的构建方法，其中，“将第二复制起始区替代所述第三复制区，以得到所述穿梭质粒”的步骤包括：利用第二引物对对运动发酵单胞菌ZM4菌株的菌液进行进行PCR扩增，以得到所述第二复制起始区的目的片段；利用第三引物对所述基础质粒进行PCR扩增，以得到第三质粒片段；将所述第二复制起始区的目的片段与所述第三质粒片段通过T5核酸外切酶连接，即得到所述穿梭质粒。3.如权利要求2所述的构建方法，其中，当所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述第二引物对具有如SEQ ID NO.9～10所示核苷酸序列，所述第三引物对具有如SEQ ID NO.21～22所示核苷酸序列；或者当所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述第二引物对具有如SEQ ID NO.11～12所示核苷酸序列，所述第三引物对具有如SEQ ID NO.22～23所示核苷酸序列；或者当所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，所述第二引物对具有如SEQ ID NO.13～14所示核苷酸序列，所述第三引物对具有如SEQ ID NO.21～22所示核苷酸序列；或者当所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，所述第二引物对具有如SEQ ID NO.15～16所示核苷酸序列，所述第三引物对具有如SEQ ID NO.21～22所示核苷酸序列；或者当所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，所述第二引物对具有如SEQ ID NO.17～18所示核苷酸序列，所述第三引物对具有如SEQ ID NO.22～23所示核苷酸序列；或者当所述第二复制起始区具有SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，所述第二引物对具有如SEQ ID NO.19～20所示核苷酸序列，所述第三引物对具有如SEQ ID NO.22～23所示核苷酸序列。4.一种穿梭质粒，其具有如SEQ ID NO.24～29任一所示的核苷酸序列，所述穿梭质粒可以在运动发酵单胞菌和大肠杆菌中穿梭，所述穿梭质粒具有在大肠杆菌中的第一复制起始区和在运动发酵单胞菌中的第二复制起始区，所述第一...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨世辉，耿碧男，伍欣艳，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：