一种以多肽为识别分子检测凋亡细菌的方法及装置制造方法及图纸

本发明专利技术涉及聚合物敏感膜离子选择性电极，具体的说是一种以多肽为识别分子检测凋亡细菌的方法及装置。以多肽或其衍生物作为识别分子和信号传导分子捕获待检测样品中的凋亡细菌，使多肽在离子交换剂掺杂的聚合物膜电极电位改变，实现对凋亡细菌的定性/定量检测。本发明专利技术中，多肽同时作为识别元件和指示离子，电极响应较快，操作简单，在实际应用方面具有较好前景。前景。前景。

【技术实现步骤摘要】
一种以多肽为识别分子检测凋亡细菌的方法及装置


[0001]本专利技术涉及聚合物敏感膜离子选择性电极，具体的说是一种以多肽为识别分子检测凋亡细菌的方法及装置。

技术介绍

[0002]细菌细胞悬浮液中活细菌和凋亡细菌的鉴定在细菌细胞增殖测定，药物敏感性试验，药物筛选等方面应用频繁。因此，建立准确有效的检测方法判断样本中细菌的凋亡与否尤为重要。正常情况下磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)位于细菌细胞膜的内部，当细菌发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸可从细胞膜内侧反转到细胞膜表面。膜联蛋白作为一种磷脂结合蛋白，能够特异性识别结合磷脂酰丝氨酸。目前最常用的检测细菌凋亡的方法是基于荧光的染色技术，将膜联蛋白进行荧光素标记制得荧光探针，从而检测凋亡。早期基于荧光的显微镜观测技术易于操作，因此被广泛用于信号分析。但由于计数室的定量比较麻烦，显微镜通常只提供定性结果。为解决这个限制，研究者使用基于荧光的酶标仪、荧光计和流式细胞仪，开发用于定量检测凋亡细菌的方法。然而膜联蛋白与磷脂酰丝氨酸的结合具有Ca
2+
依赖性，且由于膜联蛋白属于大分子，细菌细胞壁会阻挡部分膜联蛋白与细胞膜外侧磷脂酰丝氨酸的结合，从而导致测得的细菌凋亡率偏低。此外，上述仪器设备较为复杂，对操作人员有较高的技术要求。基于聚合物敏感膜离子选择电极的电位传感器制作简单，操作简便，响应速度快，不需昂贵仪器，特别适合现场快速检测，但目前尚未有相关的电位型生物传感器用于凋亡细菌的直接检测。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种以多肽为识别分子检测凋亡细菌的方法及装置
[0004]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0005]一种以多肽为识别分子检测凋亡细菌的方法，以多肽或其衍生物作为识别分子和信号传导分子捕获待检测样品中凋亡细菌(捕获过程无需Ca
2+
的存在)，使多肽在离子交换剂掺杂的聚合物膜电极电位变化，进而实现对待检测液中凋亡细菌的定量检测。
[0006]所述识别凋亡细菌的多肽能够特异性识别结合磷脂酰丝氨酸，序列为NFRLKAGAKIRFG。
[0007]所述作为识别分子和信号传导分子的多肽或其衍生物修饰于磁珠表面，形成多肽功能化磁珠，利用其与凋亡细菌细胞膜上外翻的磷脂酰丝氨酸特异性识别结合(多肽或其衍生物中的氨基酸能够与凋亡细菌细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸产生静电及疏水相互作用)，进而实现对凋亡细菌的捕获。
[0008]所述多肽及其衍生物加入至特定缓冲溶液中带有一定数量的正电荷或者负电荷；
[0009]所述多肽或多肽衍生物固定在磁珠上，具体是多肽、多肽经修饰、多肽衍生物或多肽衍生物经修饰固定在磁珠上；
[0010]例如，两端任意带有氨基和/或羧基的多肽与羧基化(或氨基化)的磁珠进行反应，
多肽固定于磁珠上；
[0011]C端修饰氨基硫醇的多肽与表面巯基化的的磁珠进行反应，多肽固定于磁珠上；
[0012]N端和/或C端经生物素(biotin)标记的多肽与链霉亲和素修饰的磁珠进行反应,多肽固定于磁珠上；
[0013]多肽衍生物若其两端任意带有氨基和/或羧基与羧基化(或氨基化)的磁珠进行反应固定于磁珠上；
[0014]多肽衍生物若其C端修饰氨基硫醇的多肽与表面巯基化的的磁珠进行反应固定于磁珠上；等等。
[0015]将离子交换剂掺杂的聚合物膜电极置于电化学池中，在外加磁场的作用下与多肽功能化磁珠被有效萃取到聚合物敏感膜相，记录多肽功能化磁珠与待检测细菌作用前后的电极电位变化。依据电极电位变化，该电位型传感器能够实现待测液中凋亡细菌的定性及定量检测。
[0016]所述多肽功能化磁珠捕获待检测样品中的凋亡细菌，由于细菌表面的蛋白质等电点较低，因此凋亡细菌带负电，导致多肽功能化磁珠中多肽电荷以及电荷密度发生变化，在外加磁场的作用下多肽功能化磁珠上多肽有效萃取到聚合物敏感膜量改变，引起电极电位变化，实现对待检测液中凋亡细菌的定量检测。
[0017]所述的细菌可以为大肠杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌等凋亡引起细胞膜内磷脂酰丝氨酸外翻的微生物，
[0018]所述离子交换剂掺杂的聚合物膜电极为电极底部粘附掺杂离子交换剂的聚合物膜，所述膜成分按重量份数计，20％
‑
80％膜基体、20％
‑
80％增塑剂，余量为离子交换剂；离子交换剂为阴离子交换剂或阳离子交换剂；其中，阴离子交换剂为三十二烷基甲基氯化铵、三十二烷基甲基氯化铵衍生物、三十四烷基甲基氯化铵或三十四烷基甲基氯化铵衍生物；阳离子交换剂为四(4
‑
氯苯基)硼酸钾、四(对甲苯基)硼酸钠、四(3,5
‑
二(三氟甲基)苯基)硼酸钠、二壬基萘磺酸、二壬基萘磺酸盐或硼酸盐或上述各化合物衍生物；
[0019]膜基体为聚氯乙烯，聚丁基丙烯酸酯，聚醚酰亚胺，橡胶或溶胶凝胶膜；增塑剂为邻硝基苯辛醚，二
‑2‑
乙基己基癸酯，癸二酸二丁酯或癸二酸二辛酯；
[0020]所述上述电位测定之后，改变外部磁场方向实现多肽功能化磁珠在膜上的分离或渗出，实现电极的可逆、重复利用。
[0021]一种所述检测方法的装置，装置包括检测池、工作电极、参比电极、电化学外部测量装置和外部磁场；所述工作电极为离子交换剂掺杂的聚合物膜电极，其置于检测池中，工作电极、参比电极、对电极分别与电化学外部测量装置相连接。
[0022]所述传感器装置电极为单通道或多通道。
[0023]所述装置包括外加磁场，可以为小型平板磁铁或电磁铁。
[0024]所述聚合物膜电极可以为传统的带内充液的聚合物膜电极、新型固态电极或印刷电极。
[0025]所述的电化学外部测量装置为电化学工作站、离子计或电位仪。
[0026]所述参比电极可以为饱和甘汞电极、银－氯化银电极；辅助电极可以为铂丝。
[0027]其中，印刷电极的工作电极可以为聚合物敏感膜覆盖的碳电极，参比电极可以为银－氯化银电极。
[0028]一种所述检测方法的应用，所述方法在评估抗菌材料的抗菌性能中的应用。
[0029]利用所述多肽检测经不同抗菌材料处理的细菌，依据多肽与细菌孵育前后电位改变的大小实现对抗菌材料抗菌性能的评估。
[0030]以上述多肽或其衍生物作为识别分子和信号传导分子与凋亡细菌相互作用，不同抗菌材料处理导致细菌凋亡率不同，使离子交换剂掺杂的聚合物膜电极电位改变不同，根据电位改变的不同实现对抗菌材料抗菌性能的评估及细菌凋亡机理的验证。
[0031]或，多肽或多肽衍生物修饰在磁珠上得到多肽功能化磁珠。多肽作为识别分子和信号传导分子与凋亡细菌相互作用，不同抗菌材料处理导致细菌凋亡率不同，使多肽功能化磁珠与细菌作用前后在离子交换剂掺杂的聚合物膜电极电位改变不同，实现对抗菌材料抗菌性能的评估及细菌凋亡机理的验证。
[0032]所述抗菌材料均能够导致细菌细胞膜上磷脂酰丝氨酸外翻，可本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以多肽为识别分子检测凋亡细菌的方法，其特征在于：以多肽或其衍生物作为识别分子和信号传导分子捕获待检测样品中的凋亡细菌，使多肽在离子交换剂掺杂的聚合物膜电极电位改变，实现对凋亡细菌的定性/定量检测。2.按权利要求1所述的以多肽为识别分子检测凋亡细菌的方法，其特征在于：所述识别凋亡细菌的多肽能够特异性识别结合磷脂酰丝氨酸，序列为NFRLKAGAKIRFG。3.按权利要求1所述的以多肽为识别分子检测凋亡细菌的方法，其特征在于：所述作为识别分子和信号传导分子的多肽或其衍生物修饰于磁珠表面，形成多肽功能化磁珠，通过其特异性识别结合凋亡细菌细胞膜上外翻的磷脂酰丝氨酸，实现对凋亡细菌的捕获。4.按权利要求1所述的以多肽为识别分子检测凋亡细菌的方法，其特征在于：所述多肽功能化磁珠捕获待检测样品中的凋亡细菌，导致多肽功能化磁珠中多肽电荷以及电荷密度发生变化，在外加磁场的作用下多肽功能化磁珠上多肽有效萃取到聚合物敏感膜量改变，引起电极电位变化，实现对待检测液中凋亡细菌的定量检测。5.按权利要求1
‑
4任意一项所述的以多肽为识别分子检测凋亡细菌的方法，其特征在于：所述离子交换剂掺杂的聚合物膜电极为电极底部粘附掺杂离子交换剂的聚合物膜，所述膜成分按重量份数计，20％
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80％膜基体、20％
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【专利技术属性】
技术研发人员：丁家旺，张晗，秦伟，
申请(专利权)人：中国科学院烟台海岸带研究所，
类型：发明
国别省市：