一种四氧化三锰/GSDME复合物的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及四氧化三锰/GSDME复合物的制备方法及其应用，可有效解决放疗后肿瘤细胞再增殖及正常组织受损的问题，其解决的技术方案是，首先在Mn3O4纳米粒表面修饰GSDME蛋白，通过单宁酸与GSDME蛋白的交联作用制备四氧化三锰/GSDME复合物，本发明专利技术制备方法稳定可靠，操作方便，所制得的Mn3O4/GSDME复合物具有生物相容性好、毒副作用小等优点，可实现GSDME蛋白的高效胞内递送，激活Caspase

【技术实现步骤摘要】
一种四氧化三锰/GSDME复合物的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及药物制备
，特别是一种四氧化三锰/GSDME复合物的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]癌症是导致死亡的主要原因。自2000年以来，中国癌症发病率和死亡率逐年上升，严重威胁人类健康，给社会造成了巨大的经济负担。放射治疗 (RT) 作为治疗恶性肿瘤的一种主要方式，临床上50%以上的癌症患者都会接受放射治疗，从分子角度来看，放疗对DNA造成直接或者活性氧 (ROS) 依赖的损伤，最终导致细胞死亡。为减少放疗期间对正常组织的损伤，常采用低剂量分割疗法使正常组织从亚致死辐射损伤中恢复，允许存活细胞在正常组织中重新繁殖。然而，存活的肿瘤细胞也会在治疗间隔期间增殖，肿瘤细胞再增殖被认为是放疗后肿瘤复发和治疗失败的主要原因。选择性地抑制肿瘤细胞再增殖有助于改善放疗治疗效果。
[0003]据报道，濒死的肿瘤细胞能够产生强大的生长刺激信号，促进附近存活肿瘤细胞的增殖。天冬氨酸半胱氨酸特异性蛋白酶
‑
3 (Caspase
‑
3) 作为细胞凋亡死亡过程中的刽子手，与肿瘤再增殖密切相关。Caspase
‑
3通过Caspase
‑
3/iPLA2/AA/PGE2、Caspase
‑
3/PKCd/Akt/VEGF
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A 信号通路释放促生长信号因子PGE2和VEGF
‑
A，强烈刺激肿瘤细胞的增殖。抑制Caspase 3可以提高肿瘤放疗效率。凋亡和焦亡都是Caspase
‑
3依赖的程序性细胞死亡途径，当肿瘤抑癌基因Gasdermin E (GSDME) 高表达时，活性Caspase
‑
3将其切割，释放N端结构域在细胞膜上穿孔，导致细胞焦亡。当GSDME表达水平较低时，会导致肿瘤细胞的经典死亡途径，即凋亡。因此，提高肿瘤细胞内GSDME含量有望激活Caspase
‑
3/GSDME信号通路，将放疗介导的细胞凋亡转变为焦亡，抑制肿瘤再增殖。
[0004]在确保放疗对肿瘤治疗有效的前提下，预防辐射性正常组织损伤是迫切需要的。四氧化三锰纳米粒 (Mn3O4) 具有多种生物酶的活性，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等，可有效清除超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基等多种活性氧 (ROS)。而且，Mn3O4可与肿瘤细胞中高表达的谷胱甘肽 (GSH) 反应，降低GSH水平，增加ROS含量。因此，Mn3O4可作为放疗保护剂清除正常组织中高剂量X射线辐射诱导的ROS保护正常组织，而在肿瘤细胞中通过下调GSH水平增加ROS含量提高放疗效率。
[0005]为实现高效的GSDME胞质递送，利用GSDME和多酚 (单宁酸) 在Mn3O4上的自组装，制备了一种Mn3O4/GSDME复合物，Mn3O4/GSDME复合物能够响应溶酶体酸性环境降解并逃逸溶酶体释放GSDME和Mn3O4到胞质中。在GSH含量低的正常细胞中，Mn3O4发挥其纳米酶活性，清除正常细胞内放疗产生的ROS，减少DNA损伤，保护正常组织；在GSH含量高的肿瘤细胞中，Mn3O4被高水平的GSH降解，其纳米酶活性丧失，GSH含量下调，胞内ROS含量升高，肿瘤放疗效果增强，更重要的是，胞内GSDME 蛋白可诱导放疗介导的细胞凋亡转变为焦亡，抑制Caspase
‑
3介导的肿瘤细胞再增殖，目前尚未见有相关报道。

技术实现思路

[0006]针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本专利技术之目的就是提供一种四氧化三锰/GSDME复合物的制备方法及其应用，可有效解决放疗后肿瘤细胞再增殖及正常组织受损的问题。
[0007]本专利技术解决的技术方案是，该复合物的制备方法是，首先在Mn3O4纳米粒表面修饰GSDME蛋白，通过单宁酸与GSDME蛋白的交联作用制备四氧化三锰/GSDME复合物，具体包括以下步骤：1）制备Mn3O4纳米粒：将1.25
‑
5 g四水合乙酸锰溶解于35
‑
140 mL N, N
‑
二甲基甲酰胺中，然后转移到反应釜中，160 ℃加热6
‑
10 h，自然冷却至室温后5000
‑
12000 rpm离心5
‑
10 min收集产物，用无水乙醇洗涤三次，40
‑
60 ℃干燥10
‑
15 h，得Mn3O4纳米粒；2）制备GSDME修饰的Mn3O4：将2.5
‑
7.5 mg Mn3O4溶解于1
‑
3 mL超纯水中，然后将15
‑
45 mg GSDME溶解于250
‑
750 μL超纯水中，将Mn3O4与GSDME超声混合2 min后转移到10
‑
20 mL圆底烧瓶中，37 ℃油浴反应8
‑
12 h。反应完成后，8000
‑
12000 rpm离心10
‑
20 min收集产物，超纯水洗涤三次去除未反应的GSDME蛋白，得GSDME修饰的Mn3O4；3）制备Mn3O4/GSDME复合物：将步骤2）制备的GSDME修饰的Mn3O4重悬于1
‑
3 mL超纯水中，并将4
‑
12 mg单宁酸溶解于25
‑
75 μL超纯水中，将两者超声混合2 min后转移到10
‑
20 mL圆底烧瓶中，37 ℃油浴反应3
‑
6 h，反应完成后，8000
‑
12000 rpm离心10
‑
20 min收集产物，并用超纯水洗涤三次去除未反应的单宁酸，得Mn3O4/GSDME复合物。
[0008]更进一步地，所述的步骤1）中Mn3O4纳米粒的粒径为5～15 nm，步骤3）中Mn3O4/GSDME复合物的粒径为100～200 nm。
[0009]本专利技术方法制备的Mn3O4/GSDME复合物在制备抗肿瘤药物注射剂中的应用。
[0010]本专利技术方法制备的Mn3O4/GSDME复合物在制备放疗保护剂中的应用。
[0011]本专利技术方法制备的Mn3O4/GSDME复合物在制备通过下调肿瘤细胞胞内GSH含量增敏肿瘤放疗药物中的应用。
[0012]本专利技术方法制备的Mn3O4/GSDME复合物在制备抑制肿瘤细胞再增殖药物中的应用。
[0013]本专利技术方法制备的Mn3O4/GSDME复合物在制备诱导肿瘤细胞焦亡联合免疫治疗药物中的应用。
[0014]本专利技术制备方法稳定可靠，操作方便，所制得的Mn3O4/GSDME复合物具有生物相容性好、毒副作用小等优点，可实现GSDME蛋白的高效胞内递送，激活Caspase
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3/GSDME信号通路，将放疗诱导的肿瘤细胞凋亡转变为焦亡抑制肿瘤再增殖；并利用肿瘤细胞与正常细胞胞内GSH含量的差异，在肿瘤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种四氧化三锰/GSDME复合物的制备方法，其特征在于，该复合物的制备方法是，首先在Mn3O4纳米粒表面修饰GSDME蛋白，通过单宁酸与GSDME蛋白的交联作用制备四氧化三锰/GSDME复合物，具体包括以下步骤：1）制备Mn3O4纳米粒：将1.25
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5 g四水合乙酸锰溶解于35
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140 mL N, N
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二甲基甲酰胺中，然后转移到反应釜中，160 ℃加热6
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10 h，自然冷却至室温后5000
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12000 rpm离心5
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10 min收集产物，用无水乙醇洗涤三次，40
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60 ℃干燥10
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15 h，得Mn3O4纳米粒；2）制备GSDME修饰的Mn3O4：将2.5
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7.5 mg Mn3O4溶解于1
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3 mL超纯水中，然后将15
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45 mg GSDME溶解于250
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750 μL超纯水中，将Mn3O4与GSDME超声混合2 min后转移到10
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20 mL圆底烧瓶中，37 ℃油浴反应8
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12 h。反应完成后，8000
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12000 rpm离心10
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20 min收集产物，超纯水洗涤三次去除未反应的GSDME蛋白，得GSDME修饰的Mn3O4；3）制备Mn3O4/GSDME复合物：将步骤2）制备的GSDME修饰的Mn3O4重悬于1
‑
3 mL超纯水中，并将4
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12 mg单宁酸溶解于25
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75 μL超纯水中，将两者超声混合2 min后转移到10
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20 mL圆底烧瓶中，37 ℃油浴反应3
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6 h，反应完成后，8000
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12000 rpm离心10
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20 min收集产物，并用超纯水洗涤三次去除未反应的单宁酸，得Mn3O4/GSDME复合物。2.根据权利要求1所述的四氧化三锰/GSDME复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1）制备Mn3O4纳米粒：将1.25 g四水合乙酸锰溶解于35 mL N, N
‑
二甲基甲酰胺中，然后转移到反应釜中，160 ℃加热8 h，自然冷却至室温后5000 rpm离心10 min收集产物，用无水乙醇洗涤三次，40 ℃干燥15 h，得Mn3O4纳米粒；2）制备GSDME修饰的Mn3O4：将2.5 mg Mn3O4溶解于1 mL超纯水中，然后将15 mg GSDME溶解于250 μL超纯水中，将Mn3O4与GSDME超声混合2 min后转移到10 mL圆底烧瓶中，37 ℃油浴反应8 h，反应完成后，8000 rpm离心20 min收集产物，超纯水洗涤三次去除未反应的GSDME蛋白，得GSDME修饰的Mn3O4；3）制备Mn3O4/GSDME复合物：将步骤2）制备的GSDME修饰的Mn3O4重悬于1 mL超纯水中，并将4 mg单宁酸溶解于25 μL超纯水中，将两者超声混合2 min后转移到10 mL圆底烧瓶中，37 ℃油浴反应4 h，反应完成后，8000 rpm离心20 min收集产物，并用超纯水洗涤三次去除未反应的单宁酸，得Mn3O4/GSDME复合物。3.根据权利要求1所述的四氧化...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘军杰，赵秀，史进进，姜文笑，王琼微，李君，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：