一种具有抗EV71病毒功能的灰树花低分子量多糖肽及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种具有抗EV71病毒功能的灰树花低分子量多糖肽及其制备方法。所述制备方法具体为：将灰树花子实体低温烘干后粉碎成粗粉；向灰树花子实体粗粉中加入70vol%乙醇醇提2次；向灰树花70%乙醇提取物残渣中加入纯水提2次；水提滤液浓缩得到灰树花水提物，再加入95%乙醇醇沉2次，收集上清液经浓缩、干燥得到灰树花水提上清物；将灰树花水提上清物依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，再加入无水乙醇醇沉2次，收集醇沉物干燥后得到灰树花低分子量多糖肽。经体外细胞实验验证，本发明专利技术制备的灰树花低分子量多糖肽具有明显的抗EV71病毒活性。EV71病毒活性。

【技术实现步骤摘要】
一种具有抗EV71病毒功能的灰树花低分子量多糖肽及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种具有抗EV71病毒功能的灰树花低分子量多糖肽及其制备方法。

技术介绍

[0002]手足口病是婴儿中常见的传染病，肠道病毒71型（EV71）是主要病原体。近几十年来，EV71主要威胁着公共卫生，严重加重了社会经济的负担。值得注意的是，这个病毒具有较强的传染性，神经系统相关的并发症比例特别高，有较高的重症率和病死率。当前临床上药物治疗效果有限，甚至长期服用容易造成肝损伤。而改善日常饮食行为，如增加富含生物活性的天然产物，将有助于抑制病毒入侵，提高机体免疫力。因此，寻找安全、有效、无毒的天然活性物质替代药物是当务之急。
[0003]蘑菇是婴幼儿重要的营养来源，具有显著的健康特性。灰树花是一种具有独特的芳香味、营养丰富、口味鲜美的食药用菌，因其显著的保健功效和广泛的生理药理活性而受到广大消费者的青睐。研究表明，灰树花中含有多糖、甾体、多酚、生物碱、三萜、皂苷、有机酸、维生素、矿物质等功效成分，使得灰树花具有抗肿瘤、增强免疫、抗病毒、降血糖及调节肠道菌群等生物活性。目前，对灰树花多糖的研究主要集中在水提醇沉后的沉淀物多糖，而醇沉过程中产生的副产物上清液中还含有一定量的小分子多糖。大部分企业将上清液按照废液进行处理，不仅浪费了优质的活性物质，还增加了生产成本。因此，灰树花水提上清液的综合利用具有重要意义。
[0004]现有技术提取的灰树花多糖的分子量过大(>1000kDa)，粘度过高，不利于溶解和吸收。基于此，本专利技术提供了一种具有抗EV71病毒功能的灰树花低分子量多糖肽及其制备方法，以期为灰树花预防和治疗婴幼儿手足口病提供重要理论依据，并促进灰树花的高值化应用开发。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种具有抗EV71病毒功能的灰树花低分子量多糖肽及其制备方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术首先提供了一种具有抗EV71病毒功能的灰树花低分子量多糖肽的制备方法，包括以下步骤：（1）将灰树花子实体干燥后粉碎，备用；（2）向灰树花粗粉中加入70vol%乙醇超声提取1h，提取结束后过滤，得到超声一次提取液和超声一次滤渣；向超声一次滤渣中加入70vol%乙醇超声提取1h，提取结束后过滤，得到超声二次提取液和超声二次滤渣；将超声二次滤渣于烘箱中干燥；（3）向烘干后的超声二次滤渣中加入纯水超声提取1h，提取结束后过滤，得到超声
三次提取液和超声三次滤渣；向超声三次滤渣中加入纯水超声提取1h，提取结束后过滤，得到超声四次提取液和超声四次滤渣；将超声三次提取液和超声四次提取液合并后进行旋转蒸发浓缩，得到灰树花水提物；（4）向灰树花水提物中加入95vol%乙醇进行第一醇沉，醇沉结束后离心分离得到醇沉一次上清液和醇沉一次沉淀；将醇沉一次沉淀溶解于纯水，再加入95vol%乙醇进行第二醇沉，醇沉结束后离心分离后得到醇沉二次上清液和醇沉二次沉淀；将醇沉二次上清液减压浓缩，得到灰树花水提上清液；（5）将灰树花水提上清液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，萃取完成后，将有机溶剂蒸干，向萃后剩余的水相中加入无水乙醇进行第三醇沉，醇沉结束后离心分离得到醇沉三次上清液和醇沉三次沉淀；在醇沉三次上清液中加入无水乙醇进行第四醇沉，醇沉结束后离心分离得到醇沉四次上清液和醇沉四次沉淀；将醇沉三次沉淀和四次沉淀混合后进行真空冷冻干燥，即得到所述灰树花低分子量多糖肽。
[0007]进一步的，上述步骤（2）中，所述超声的工艺条件为：超声处理温度50℃，超声功率400W，超声频率45KHz。
[0008]进一步的，上述步骤（3）中，所述超声的工艺条件为：超声处理温度80℃，超声功率400W，超声频率45KHz。
[0009] 进一步的，上述步骤（3）中，所述灰树花水提物的比重为0.1 g/cm3。
[0010]进一步的，上述步骤（4）中，所述醇沉的工艺条件为：醇沉温度4℃，沉淀时间12~24h。
[0011] 进一步的，上述步骤（4）中，所述灰树花水提上清液的比重为0.1 g/cm3。
[0012]进一步的，上述步骤（5）中，所述醇沉的工艺条件为：醇沉温度4℃，沉淀时间12~24h。
[0013]进一步的，上述步骤（5）中，所述真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度
‑
50℃，预冻时间为8小时，升华温度为30℃，解析温度为45℃，真空度为0.1MPa，真空冷冻干燥时间为36小时。
[0014]本专利技术还提供了一种利用上述制备方法得到的灰树花低分子量多糖肽。
[0015]本专利技术还提供了上述一种灰树花低分子量多糖肽在制备抗EV71病毒药物中的应用。
[0016]本专利技术的有益效果在于：（1）本专利技术提供了一种具有抗EV71病毒功能的灰树花低分子量多糖肽及其制备方法，对灰树花醇提后的残渣进行水提综合利用，醇沉得到多糖后产生的副产物上清液进行分离纯化，从而得到水溶性好的低分子量多糖肽，该制备方法成本低、活性高、综合利用原料、且可以大规模生产。
[0017]（2）本专利技术制备得到的灰树花低分子量多糖肽具有抗EV71病毒作用。浓度为25μg/mL时，灰树花低分子量多糖肽具有显著抗EV71病毒活性（P＜0.05）。浓度为50
‑
200 μg/mL时，灰树花低分子量多糖肽具有极显著抗EV71病毒活性（P＜0.01）。并且在浓度50
‑
200 μg/mL之间，对EV71病毒的抑制作用显著高于阳性药物利巴韦林（P＜0.05）。以期为灰树花水提上清液的活性研究提供试验基础，也为提高灰树花的商业价值提供理论支持。
附图说明
[0018]图1为灰树花低分子量多糖肽的制备工艺流程图。
[0019]图2为灰树花低分子量多糖肽的分子量分布图。
[0020]图3为单糖标品出峰时间图（A）；灰树花低分子量多糖肽的单糖组成出峰时间图（B）。
[0021]图4为灰树花低分子量多糖肽对Vero细胞的增殖的影响；与正常组相比，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
[0022]图5制备得到的灰树花低分子量多糖肽的抗EV71病毒活性；与正常组相比，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01；与模型组相比，#代表P＜0.05，##代表P＜0.01；与阳性药物组相比，
△
代表P＜0.05，
△△
代表P＜0.01。
具体实施方式
[0023]为进一步公开而不是限制本专利技术，以下结合实施例对本专利技术作进一步的详细说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0024]实施例1本专利技术所述一种具有抗EV71病毒功能的灰树花低分子量多糖肽的制备方法其工艺流程如图1所示，所述制备方法具体包括以下步骤：（1）将灰树花子实体于50℃烘箱中干燥6 h后粉本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有抗EV71病毒功能的灰树花低分子量多糖肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）将灰树花子实体干燥后粉碎，备用；（2）向灰树花粗粉中加入70vol%乙醇超声提取1h，提取结束后过滤，得到超声一次提取液和超声一次滤渣；向超声一次滤渣中加入70vol%乙醇超声提取1h，提取结束后过滤，得到超声二次提取液和超声二次滤渣；将超声二次滤渣于烘箱中干燥；（3）向烘干后的超声二次滤渣中加入纯水超声提取1h，提取结束后过滤，得到超声三次提取液和超声三次滤渣；向超声三次滤渣中加入纯水超声提取1h，提取结束后过滤，得到超声四次提取液和超声四次滤渣；将超声三次提取液和超声四次提取液合并后进行旋转蒸发浓缩，得到灰树花水提物；（4）向灰树花水提物中加入95vol%乙醇进行第一醇沉，醇沉结束后离心分离得到醇沉一次上清液和醇沉一次沉淀；将醇沉一次沉淀溶解于纯水，再加入95vol%乙醇进行第二醇沉，醇沉结束后离心分离后得到醇沉二次上清液和醇沉二次沉淀；将醇沉二次上清液减压浓缩，得到灰树花水提上清液；（5）将灰树花水提上清液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，萃取完成后，将有机溶剂蒸干，向萃后剩余的水相中加入无水乙醇进行第三醇沉，醇沉结束后离心分离得到醇沉三次上清液和醇沉三次沉淀；在醇沉三次上清液中加入无水乙醇进行第四醇沉，醇沉结束后离心分离得到醇沉四次上清液和醇沉四次沉淀；将醇沉三次沉淀和四...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘斌，熊雯宇，何君强，曾峰，林震山，彭培植，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：