一种用于检测睾酮及其同分异构体的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测睾酮及其同分异构体的方法，包括样品前处、配置标准工作液、以及使用液相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测睾酮及其同分异构体的方法


[0001]本专利技术涉及一种生物标志物的检测方法，尤其是涉及一种用于检测睾酮及其同分异构体的方法。

技术介绍

[0002]LC
‑
MS/MS即液相色谱与串联质谱联用，是一种结合了液相色谱(LC)的物理分离能力和质谱(MS)的质谱分析能力的分析化学技术。与LC
‑
MS相比， LC
‑
MS/MS结合两个质谱仪的分析能力，一级质谱MS1用于分析过滤前体离子，一级质谱MS2用于分析前体离子碎裂后产生的碎片离子，提高检测的灵敏度，且利用碎片离子的图谱可以获得更多关于分析物的结构信息。
[0003]LC
‑
MS/MS质谱分析不仅可用于检测残留化合物、鉴定有机小分子以及确认和定量制药和食品样品中的污染物和掺杂物，另外，还可以用于分析蛋白质等大分子物质，例如蛋白质测序、蛋白质翻译后修饰位点分析、定量蛋白质组学等。在LC
‑
MS/MS分析中，样品溶液首先进入色谱仪，不同物质与色谱仪中的固定相和流动相之间的相互作用不同而导致迁移速率不同，从而实现样品组分的分离。分离出的不同组分会被电离形成带电离子，经MS1分析过滤后，选定的母离子与惰性气体碰撞分裂成子离子，子离子再进入MS2被分析。这一系列的分离、电离和选择性碎裂可以提供高度灵敏的检测结果。
[0004]虽然LC
‑
MS/MS技术具有突出的特异性，但是其对于检测同分异构体仍是一个较大的挑战，比如对于睾酮和11
‑r/>β甲基
‑
19
‑
去甲睾酮(11β
‑
MNT)的检测。 11β
‑
MNT是19
‑
去甲睾酮的衍生物，是一种合成代谢的类固醇雄激素(AAS)。而睾酮在所有人体内几乎都存在；睾酮和11β
‑
MNT由于其相似的甾体结构而具有相似的碎裂模式；因此，睾酮和11β
‑
MNT具有相同的离子对，不能被MRM 模式分离开。此外，睾酮和11β
‑
MNT具有非常相似的化学结构，使用反向色谱柱很难在短时间内进行分离；并且较长的洗脱梯度减小了检测的通量，会极大限制方法的实际运用。
[0005]因此，有必要提供一种新的技术方案以克服上述缺陷。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种用于检测睾酮及其同分异构体的方法，该检测方法采用手性柱，可对睾酮和11β
‑
MNT进行快速分离，并对两者进行定量分析，从而解决了现有技术中使用反向色谱柱分离睾酮和11β
‑
MNT效率低，导致检测精度差的技术问题。
[0007]为达到本专利技术之目的，采用如下技术方案：
[0008]一种用于检测睾酮及其同分异构体的方法，包括如下步骤：
[0009]S1：样品前处理：
[0010]S1a：取150ul血清样本溶液于1.5ml离心管中，加入10ul内标，涡旋混匀后加入150ul醋酸钠缓冲溶液，然后涡旋振荡2h，得到混合溶液；
[0011]S1b：在步骤S1a获得的混合溶液中加入乙酸乙酯和正己烷溶液600ul进行萃取，振
荡40min；然后在18000g下离心15min，并收集有机相1；
[0012]S1c：重复上述S1b的步骤再进行一次萃取，得到有机相2，将有机相1和有机相2合并后放入离心蒸发器中完全蒸发，蒸发处理后加入150ul碳酸铵缓冲溶液进行复溶；复溶后的溶液使用600ul正己烷溶液萃取两次，得到有机相3，将有机相3放入离心蒸发器中将有机相完全蒸发，最后再加入150ul 75％的乙腈水溶液复溶，得到样品溶液；
[0013]S2：配置标准工作液：
[0014]S2a：取睾酮标准品，加入溶解液溶解配制成含睾酮的标准工作液；
[0015]S2b：取睾酮的同分异构体标准品，加入溶解液溶解配制成睾酮的同分异构体的标准工作液；
[0016]S3：使用液相色谱
‑
质谱联用仪进行检测：
[0017]由自动进样器分别吸取样品溶液、含睾酮的标准工作液、含睾酮的同分异构体的标准工作液，注入液相色谱
‑
质谱联用仪中，进行检测。
[0018]优选的，所述睾酮的同分异构体为11β
‑
MNT。
[0019]优选的，所述步骤S3中使用液相色谱
‑
质谱联用仪进行检测时，色谱条件如下：
[0020]色谱柱：Astec CYCLOBOND I 2000column；
[0021]流动相：A相：10mM甲酸水溶液；B相：10mM甲酸乙腈溶液；
[0022]洗脱梯度为：
[0023]0‑
5min 50％B相；5
‑
5.75min 98％B相；5.75
‑
12min 98％B相；12
‑
12.1min 50％B 相；12.1
‑
15min 50％B。
[0024]优选的，所述色谱柱的规格为5μm,50
×
2.1mm。
[0025]优选的，所述流动相的流速为0.4mL/min。
[0026]优选的，所述色谱柱的柱温为25度。
[0027]优选的，所述步骤S3中使用液相色谱
‑
质谱联用仪进行检测时，质谱条件如下：
[0028]离子化方式：ESI+；扫描方式：MRM；离子源温度：150度；脱溶剂气温度：500度；脱溶剂气流速：600L/h；锥孔电压：2.8KV。
[0029]优选的，当待测物为睾酮时，监测离子对为289/97。
[0030]优选的，当待测物为11β
‑
MNT时，监测离子对为289/109。
[0031]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0032]本专利技术所采用的方法，与现有技术相比，其采用手性柱代替反向色谱柱，对睾酮和11β
‑
MNT进行分离，其分离速度快，效率高，实现了对睾酮和11β
ꢀ‑
MNT的快速分离和定量分析；此外，本专利技术所采用的方法不仅线性关系好，而且检测值的准确度和精密度较高。
具体实施方式
[0033]为了使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本专利技术的部分实施例，而不是全部实施例。
[0034]下面将对本专利技术一种用于检测睾酮及其同分异构体的方法做出清楚完整的说明。
[0035]以下所用试剂及仪器，无特殊说明的，均可在市面上后购买得到。
[0036]本专利技术提供的一种用于检测睾酮及其同分异构体的方法，包括如下步骤：
[0037]S1：样品前处理：
[0038]S1a：取150ul血清样本溶液于1.5ml本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测睾酮及其同分异构体的方法，其特征在于：包括如下步骤：S1：样品前处理：S1a：取150ul血清样本溶液于1.5ml离心管中，加入10ul内标，涡旋混匀后加入150ul醋酸钠缓冲溶液，然后涡旋振荡2h，得到混合溶液；S1b：在步骤S1a获得的混合溶液中加入乙酸乙酯和正己烷溶液600ul进行萃取，振荡40min；然后在18000g下离心15min，并收集有机相1；S1c：重复上述S1b的步骤再进行一次萃取，得到有机相2，将有机相1和有机相2合并后放入离心蒸发器中完全蒸发，蒸发处理后加入150ul碳酸铵缓冲溶液进行复溶；复溶后的溶液使用600ul正己烷溶液萃取两次，得到有机相3，将有机相3放入离心蒸发器中将有机相完全蒸发，最后再加入150ul75％的乙腈水溶液复溶，得到样品溶液；S2：配置标准工作液：S2a：取睾酮标准品，加入溶解液溶解配制成含睾酮的标准工作液；S2b：取睾酮的同分异构体标准品，加入溶解液溶解配制成的睾酮的同分异构体的标准工作液；S3：使用液相色谱
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质谱联用仪进行检测：由自动进样器分别吸取样品溶液、含睾酮的标准工作液、含睾酮的同分异构体的标准工作液，注入液相色谱
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质谱联用仪中，进行检测。2.根据权利要求1所述的一种用于检测睾酮及其同分异构体的方法，其特征在于：所述睾酮的同分异构体为11β
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MNT。3.根据权利要求1或2所述的一种用于检测睾酮及其同分异构体的方法，其特征在于：所述步骤S3中使用液相色谱
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质谱联用仪进行检测时，色谱条件如下：色...

【专利技术属性】
技术研发人员：矫文策，黄康鹏，
申请(专利权)人：中科润生康泰苏州医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：