重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒及其用途制造技术

本发明专利技术涉及医药领域，特别是涉及重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒及其用途，所述重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒由基因组中整合有编码柯萨奇病毒A16的VP0、VP1和VP3衣壳蛋白的细胞系产生。本发明专利技术还提供所述重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒在制备预防手足口病产品中的用途。所述预防手足口病产品为药物组合物，例如为疫苗组合物。在免疫原性研究中发现本发明专利技术的柯萨奇病毒A16VLP可在小鼠体内诱导良好的免疫反应，提示该VLP可作为柯萨奇病毒A16的候选疫苗。提示该VLP可作为柯萨奇病毒A16的候选疫苗。

【技术实现步骤摘要】
重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒及其用途


[0001]本专利技术涉及医药领域，特别是涉及重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒及其用途。

技术介绍

[0002]手足口病是一种常见的婴幼儿传染病，主要临床表现为手、足和口腔等部位出现小疱疹或小溃疡，少数患儿可引起肺水肿、无菌性脑膜脑炎、心肌炎等一系列并发症甚至导致死亡。手足口病是由人肠道病毒属的柯萨奇病毒A组16、4、5、7、9、10，B组2、5型以及肠道病毒71型和埃可病毒30感染引起的，其中肠道病毒71和柯萨奇病毒A16是导致手足口病暴发的主要病原体。目前，肠道病毒A71已有商品化的灭活疫苗，这将大大降低了肠道病毒A71相关手足口病的发病率，而对于柯萨奇病毒A16的疫苗还处于临床前研究。
[0003]柯萨奇病毒A16属于小RNA病毒科肠道病毒属A，是无包膜的二十面立体对称球形颗粒，直径约30nm，其基因组是单股正链RNA，两端为保守的非编码区，中间为含有1个开放阅读框的编码区，编码一个蛋白前体，这个蛋白前体可以进一步加工成结构蛋白P1和非结构蛋白P2和P3，而P1可被病毒编码的蛋白酶加工成为病毒衣壳蛋白VP0，VP1和VP3，这些病毒衣壳蛋白与病毒RNA一起组装为成熟的病毒，并伴随着VP0切割为VP2和VP4。据报道，柯萨奇病毒A16的结构蛋白P1与非结构蛋白3CD共表达，可切割为VP0、VP3和VP1衣壳蛋白，并进一步组装成柯萨奇病毒A16病毒样颗粒(Virus
‑
like particle，VLP)与成熟病毒结构上相似，具有良好的免疫原性。VLP免疫后可保护小鼠免于柯萨奇A16病毒的攻击，但通过该方式获得的VLP
‑
P1/3CD
存在着P1切割不完全的现象，影响其组成的均一性。3CD是病毒的蛋白酶，其残留也存在潜在的安全性因素。此外，柯萨奇病毒A16 VLP的组分VP1衣壳蛋白易发生降解，也严重影响了其组成的一致性，这对产品的质量控制造成较大的潜在风险。

技术实现思路

[0004]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒及其用途，用于解决现有技术中的问题。
[0005]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包括编码柯萨奇病毒A16的VP0、VP1和VP3衣壳蛋白的核苷酸，所述多核苷酸不包括RBS序列和编码柯萨奇病毒A16其他衣壳蛋白的核苷酸。
[0006]本专利技术还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体所述多核苷酸。
[0007]本专利技术还提供一种细胞系，所述细胞系中包括所述核酸构建体，或基因组中整合有所述多核苷酸。
[0008]本专利技术还提供一种重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒，所述重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒包括VP0、VP1和VP3衣壳蛋白，不包括柯萨奇病毒A16其他衣壳蛋白。
[0009]本专利技术还提供所述重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒在制备预防手足口病产品中的用途。
[0010]本专利技术还提供一种用于预防手足口病的药物组合物，所述药物组合物包括所述重
组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒和药学上可接受的载体。
[0011]如上所述，本专利技术的重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒及其用途，具有以下有益效果：病毒样颗粒与病毒在形态与组成上相似，可诱导较好的免疫反应，为柯萨奇病毒A16疫苗的开发提供了解决方案，为预防柯萨奇病毒A16感染提供有效方法。
附图说明
[0012]图1显示为本专利技术的表达框示意图，PAOX1为AOX1启动子，CYC1 TT为CYC1终止子，VP0、VP3和VP1为柯萨奇病毒A16衣壳蛋白序列。
[0013]图2显示为SDS
‑
PAGE分析各A16 VLPs，(A)A16 VLP
‑
P1/3CD
的SDS
‑
PAGE分析，(B)A16 VLP
‑
full
的SDS
‑
PAGE分析，(C)A16 VLP
‑
N50
的SDS
‑
PAGE分析，(D)A16 VLP
‑
N72
的SDS
‑
PAGE分析。
[0014]图3显示为柯萨奇病毒A16 VLPs粒径分析图，图中Bar＝100nm，(A)A16 VLP
‑
P1/3CD
电镜分析(B)A16 VLP
‑
full
电镜分析，(C)A16 VLP
‑
full
的动态光散射分析，(D)A16 VLP
‑
N50
的动态光散射分析，(E)A16 VLP
‑
N72
的动态光散射分析。
[0015]图4显示为柯萨奇病毒A16 VLPs免疫血清特异抗体滴度，(A)二免后血清滴度(VLP
‑
P1/3CD
与VLP
‑
full
免疫原性比较)；(B)二免后血清滴度(VLP
‑
full
、VLP
‑
N50
及VLP
‑
N72
免疫原性比较)；(C)三免后血清滴度(VLP
‑
full
、VLP
‑
N50
及VLP
‑
N72
免疫原性比较)。为了方便统计，将OD450nm吸光值大于0.15的最高稀释倍数的倒数定位该样品的特异抗体滴度，横线显示为几何平均值。
具体实施方式
[0016]为解决结构蛋白P1的不完全切割问题，本专利技术构建了含有柯萨奇病毒A16 VP0、VP3和VP1三个串联表达框的毕赤酵母表达菌株，并成功纯化了VLP
‑
full
；动物免疫结果显示，VLP
‑
full
的免疫原性与共表达P1和3CD获得的VLP
‑
P1/3CD
免疫原性相当。
[0017]为了解决VP1的降解问题，本专利技术在串联表达柯萨奇病毒A16 VP0、VP3和VP1的基础上，对VP1 N端进行50个和72个氨基酸的截短，并分别获得了毕赤酵母表达菌株和纯化后的VLP
‑
N50
和VLP
‑
N72
；SDS
‑
PAGE显示VLP
‑
N50
和VLP
‑
N72
的VP1均无明显降解，且免疫小鼠发现不论VLP
‑
N50
还是VLP
‑
N72
诱导的免疫水平均与VLP
‑
full
相当。因此，经串联表达衣壳蛋白VP0、VP3和截短VP1获得的柯萨奇病毒A16 VLP不仅解决了P1不完全切割和VP1降解的组成均一性问题，同时兼具良好的免疫原性，为柯萨奇疫病毒A16疫苗的研发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括编码柯萨奇病毒A16的VP0、VP1和VP3衣壳蛋白的核苷酸，所述多核苷酸不包括RBS序列和编码柯萨奇病毒A16其他衣壳蛋白的核苷酸。2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸中编码柯萨奇病毒A16的VP0、VP1和VP3衣壳蛋白的核苷酸的排列顺序为：VP0
‑
VP3
‑
VP1。3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸中各核苷酸的排列顺序为：启动子
‑
VP0
‑
终止子
‑
启动子
‑
VP3
‑
终止子
‑
启动子
‑
VP1
‑
终止子。4.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，还包括以下中的任一项或多项：1)所述编码柯萨奇病毒A16的VP0衣壳蛋白的核苷酸为VP0全长核苷酸序列或截短的核苷酸；2)所述编码柯萨奇病毒A16的VP1衣壳蛋白的核苷酸为VP1全长核苷酸序列或截短的核苷酸；3)所述编码柯萨奇病毒A16的VP3衣壳蛋白的核苷酸为VP3衣壳蛋白的全长核苷酸序列或截短的核苷酸序列。5.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码的柯萨奇病毒A16的VP1衣壳蛋白为截短45
‑
75个氨基酸的VP1衣壳蛋白。6.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，还包括以下中的一项或几项：1)编码柯萨奇病毒A16的VP0衣壳蛋白的核苷酸的序列如SEQ ID NO:8所示；2)编码柯萨奇病毒A16的VP1衣壳蛋白的核苷酸的序列如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示；3)编码柯萨奇病毒A16的VP3衣壳蛋白的核苷酸的序列如SEQ ID NO:9所示。7.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，还包括以下中的一项或几项：1)...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘庆伟，王晓黎，刘艳，石娜，张玺，边金，秦松，阮丽珠，
申请(专利权)人：华淞上海生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：