取代的胍基试剂和取代的脒基试剂及其用于蛋白质变性的用途制造技术

本公开涉及一种用于蛋白质变性的组合物的系统。组合物包含非亲核变性剂，该非亲核变性剂包括取代的胍，其中变性剂具有大于约10的pKa值，并且其中取代的胍的浓度小于250mM。并且其中取代的胍的浓度小于250mM。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】取代的胍基试剂和取代的脒基试剂及其用于蛋白质变性的用途
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年6月12日提交的名称为“Substituted Guanidino and Amidino Reagents and The Use Thereof for Protein Denaturation”的美国临时申请号63/038,366的权益和优先权。该申请的内容全文以引用方式并入本文。


[0003]本公开整体涉及使蛋白质变性。更具体地，本公开涉及使用取代的胍基试剂和取代的脒基试剂来破坏蛋白质结构。

技术介绍

[0004]离子可以基于其对水的有序作用还是相反地无序作用而具有稳定或不稳定作用。在引起水配位增加的离子的情况下，发现蛋白质结构稳定。继而，可能需要各种样品制备方法使这些蛋白质结构变性以用于分析。

技术实现思路

[0005]一些蛋白质耐变性，这需要发现更强大的变性剂。然而，使用太多变性剂具有过程缺点。本公开描述了两种变性剂：取代的胍基试剂和取代的脒基试剂，这些试剂是非亲核的。这使得可以使用取代的胍基试剂和取代的脒基试剂，而不会对涉及亲电试剂的下游衍生化反应施加任何干扰。
[0006]在一些方面，本公开提供了一种用于蛋白质变性的组合物。组合物包含非亲核变性剂，该非亲核变性剂包括取代的胍。变性剂具有大于约10的pKa值，并且取代的胍的浓度小于250mM。
[0007]在一些实施方案中，取代的胍选自基本上由四甲基胍、叔丁基四甲基胍、三氮杂双环癸烯或它们的组合组成的组。在一些实施方案中，取代的胍包括来自四甲基胍、叔丁基四甲基胍、三氮杂双环癸烯或它们的组合的组中的至少一者。在一些实施方案中，四甲基胍的取代的胍是具有以下化学结构的1，1，3，3
‑
四甲基胍：
[0008][0009]在一些实施方案中，叔丁基四甲基胍的取代的胍是具有以下化学结构的2
‑
叔丁基
‑
1，1，3，3
‑
四甲基胍：
[0010][0011]在一些实施方案中，三氮杂双环癸烯的取代的胍是具有以下化学结构的1，5，7
‑
三氮杂双环[4.4.0]癸
‑5‑
烯：
[0012][0013]在一些实施方案中，取代的胍是胍盐阳离子。在一些实施方案中，组合物还包含来自十二烷基硫酸钠、n
‑
月桂酰肌氨酸、月桂酸、胆酸或它们的组合的组中的至少一者的附加变性剂。
[0014]在一些方面，本公开提供了一种用于蛋白质变性的组合物。组合物包含非亲核变性剂，该非亲核变性剂包括取代的脒。变性剂具有大于约10的pKa值，并且取代的脒的浓度小于250mM。
[0015]在一些实施方案中，取代的脒选自基本上由己脒、乙脒、丙脒或它们的组合组成的组。在一些实施方案中，取代的脒包括来自己脒、乙脒、丙脒或它们的组合的组中的至少一者。
[0016]在一些方面，本公开提供了一种使包含蛋白质的样品变性的方法。该方法包括：用非亲核变性剂孵育样品；加热样品达预定时间量，以使蛋白质变性；以及将样品冷却到降低的温度。变性剂的浓度小于约250mM，并且变性剂具有大于约10的pKa值。
[0017]在一些实施方案中，非亲核变性剂包括取代的胍、取代的脒或它们的组合。在一些实施方案中，取代的胍包括四甲基胍、叔丁基四甲基胍、三氮杂双环癸烯或它们的组合。在一些实施方案中，取代的脒包括己脒、乙脒、丙脒或它们的组合。在一些实施方案中，当温度降低到降低的温度时，变性的蛋白质被展开并且保持展开。在一些实施方案中，非亲核变性剂选自基本上由四甲基胍、叔丁基四甲基胍、三氮杂双环癸烯或它们的组合组成的组。在一些实施方案中，加热样品包括将样品加热到至少40℃的温度。在一些实施方案中，加热样品包括将样品加热到在约40℃至约100℃范围内的温度。在一些实施方案中，降低的温度在约30℃至75℃的范围内。在一些实施方案中，该方法包括稀释冷却的样品以及/或者消化冷却的样品。在一些实施方案中，该方法包括用蛋白酶消化样品。在一些实施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶、Lys
‑
C、Arg
‑
C、Glu
‑
C、Asp
‑
N、胰凝乳蛋白酶或它们的组合。在一些实施方案中，该方法包括用内切糖苷酶或外切糖苷酶处理冷却的样品。
[0018]本公开提供了许多优点，包括：使用非亲核的取代的胍基试剂和取代的脒基试剂作为变性剂，而不会对涉及亲电试剂的下游衍生化反应施加任何干扰。虽然不希望受理论的束缚，但可以合理认为，取代的胍基试剂和取代的脒基试剂具有独特的能力：能够与阴离子蛋白质位点形成强离子对，并且同时将疏水性引入蛋白质结构域的局部微环境。据信这
种两亲特性破坏离子配对的蛋白质结构域的溶剂化，使得熵不再有利于其在其天然结构中折叠。这些取代的胍基试剂和取代的脒基试剂对于实现酸性结构的完全变性可能是特别有利的，同时足够两亲以会聚到胶束体系中，该胶束体系可以固有地破坏蛋白质结构。取代的胍基试剂可以在温度循环和小稀释因子下有效使用，以将来自苛刻变性条件的样品转变为仅部分变性的样品，使得可以容易地采用酶。并且取代的脒基试剂可能对高温样品制备步骤提供足够的变性力，并且然后在较低温度下足够温和，以便不干扰随后的酶促反应。
附图说明
[0019]通过以下结合附图所作的详细描述，将更充分地理解本技术，在附图中：
[0020]图1是消化工作流程的示例的流程图。
[0021]图2展示了根据本公开的通过兔IgG的天然荧光随盐酸胍浓度的变化观察到的蛋白质变性。
[0022]图3展示了根据本公开的在不同温度下用不同取代的胍试剂(试剂1、试剂2和试剂3)孵育之后的兔IgG的荧光发射强度比。
[0023]图4展示了根据本公开的在不同温度下用不同取代的脒基试剂(试剂4、试剂5和试剂6)孵育之后的兔IgG的荧光发射强度比。
[0024]图5A至图5E展示了根据本公开的在用各种试剂进行变性和PNGase F去糖基化之前和之后的(阿巴西普，可从Bristol
‑
Myers Squibb获得)的完整蛋白质RPLC的反相LC
‑
MS色谱图。
[0025]图6展示了根据本公开的由衍生于的RapiFluor
‑
MS
TM
(可从Waters Technologies Corporation，Milford MA商购获得))标记的N
‑
聚糖的混合模式分离和用试剂#1(1，1，3，3
‑
四甲基胍)进行变性引起的荧光。
[0026]图7A至图7D是展示根据本公开的消化缓冲液中的用于通过通用LC
‑
MS方法分析肽图的1mM每种四甲基胍变性剂(图7A是空白；试剂#1，图7B；试剂#2，图7C；和试剂#3，图7D)的曲线图。
[0027]图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于蛋白质变性的组合物，所述组合物包含：非亲核变性剂，所述非亲核变性剂包括取代的胍，其中所述变性剂具有大于约10的pKa值，并且其中所述取代的胍的浓度小于250mM。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述取代的胍选自基本上由四甲基胍、叔丁基四甲基胍、三氮杂双环癸烯或它们的组合组成的组。3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述取代的胍包括来自四甲基胍、叔丁基四甲基胍、三氮杂双环癸烯或它们的组合的组中的至少一者。4.根据权利要求3所述的组合物，其中四甲基胍的所述取代的胍是具有以下化学结构的1，1，3，3
‑
四甲基胍：5.根据权利要求3所述的组合物，其中叔丁基四甲基胍的所述取代的胍是具有以下化学结构的2
‑
叔丁基
‑
1，1，3，3
‑
四甲基胍：6.根据权利要求3所述的组合物，其中三氮杂双环癸烯的所述取代的胍是具有以下化学结构的1，5，7
‑
三氮杂双环[4.4.0]癸
‑5‑
烯：7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述取代的胍是胍盐阳离子。8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物还包含来自十二烷基硫酸钠、n
‑
月桂酰肌氨酸、月桂酸、胆酸或它们的组合的组中的至少一者的附加变性剂。9.一种用于蛋白质变性的组合物，所述组合物包含：非亲核变性剂，所述非亲核变性剂包括取代的脒，其中所述变性剂具有大于约10的pKa值，并且其中所述取代的脒的浓度小于250mM。10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述取代的脒选自基本上由己脒、乙脒、丙脒或它们的组合组成的组。
11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述取代的脒包括来自己脒、乙脒、丙脒或它们的组合的组中的至少一者。12.一种使包含蛋白质的样品...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘潇潇，李文静，M，
申请(专利权)人：沃特世科技公司，
类型：发明
国别省市：