一种蛋白酶活力的测定方法技术

本发明专利技术属于酶活力测定方法领域，针对现有的蛋白酶活力测定技术存在的灵敏度低，酶浓度曲线不过原点的问题，本发明专利技术提供一种蛋白酶活力的测定方法：配制酪蛋白溶液，取用酪蛋白溶液上清液为溶剂配制的不同浓度的色氨酸或牛血清白蛋白标准溶液，在碱性条件下加入新鲜配制的MBTH试剂，加入酸性铁试剂，进行显色反应，测定吸光度值，根据每组色氨酸或牛血清白蛋白浓度与测得的吸光度值之间的关系并绘制标准对应关系曲线；取用酪蛋白溶液，加入蛋白酶，进行酶解反应，并测定吸光度值，计算蛋白酶酶活力。与现有技术的紫外法和Lowrry法相比该方法更灵敏、更准确，显色产物更加稳定。显色产物更加稳定。

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白酶活力的测定方法


[0001]本专利技术属于酶活力测定
，具体涉及的是一种蛋白酶活力的测定方法。

技术介绍

[0002]蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称。近年来，因其在食品、医药、医疗诊断、饲料和环境等领域具有较大的应用价值而倍受关注。按蛋白酶水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。酶活力是衡量酶活性的重要指标，一般采用测定酶促反应初速度的方法来测定酶活力，所测的酶活力为上述两类酶的总酶活力。以色氨酸为酶活力单位计量的标准物质为例，蛋白酶的活力单位可被定义为在一定酶解条件下，每毫升反应液中，每分钟产生1μmol相当于色氨酸的量为一个酶活力单位。
[0003]现阶段对酶活力的测定方法有：电泳法、偶氮酪蛋白法、荧光光度法、紫外法和Lowrry法等，但是这些方法测定蛋白酶活力均存在缺陷，如电泳法只能通过条带定性分析出蛋白酶对蛋白底物的破坏情况，但较难量化酶活力；偶氮酪蛋白法所用底物为合成底物而非天然底物，且价格昂贵，不仅如此，其酶活力定义也只能采用增加0.01个吸光度值来表示1个蛋白酶活力单位，很难做到广泛的普及应用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蛋白酶活力的测定方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)配制酪蛋白上清液和蛋白酶溶液：a.用碱性溶液将酪蛋白溶解，调pH值至待测pH值，再用待测pH值的缓冲液定容，得到酪蛋白溶液Ⅰ，此酪蛋白溶液Ⅰ适用于测定碱性蛋白酶和中性蛋白酶活力；用碱性溶液将酪蛋白溶解，再将溶解的酪蛋白溶液逐滴加入到缓冲液的共轭酸溶液中并剧烈搅拌，调pH值至待测pH值，再用待测pH值的缓冲液定容，得到酪蛋白溶液Ⅰ，此酪蛋白溶液Ⅰ适用于测定酸性蛋白酶活力；用同一所述待测pH值的缓冲液配制相应的蛋白酶溶液；所述的碱性溶液为NaOH溶液、KOH溶液或所述缓冲液中的共轭碱溶液；b.将步骤a的酪蛋白溶液Ⅰ用所述待测pH值的缓冲液稀释，得酪蛋白溶液Ⅱ，再加入三氯乙酸溶液，离心或过滤，得到酪蛋白上清液；(2)绘制标准物质的吸光度值与标准物质浓度的标准对应关系曲线：
①
用步骤b的酪蛋白上清液为溶剂，配制一系列浓度梯度的标准物质溶液，得到含相同酪蛋白浓度的标准物质溶液，所采用的标准物质为色氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、牛血清白蛋白、谷氨酸中的任意一种；
②
向步骤
①
的标准物质溶液中，加入碱性试剂，混匀，加入新鲜配制的MBTH溶液，体系中OH
‑
浓度范围为0.01
‑
0.2mol/L，MBTH的初始浓度范围为0.3
‑
4.5mmol/L，在50
‑
100℃条件下反应5
‑
180min；再加入酸性铁试剂，反应体系变成酸性，体系中H
+
的浓度范围为0.02
‑
0.3mol/L，Fe
3+
的初始浓度范围为1
‑
6mmol/L，发生显色反应，显色稳定后在580
‑
680nm波长下测定吸光度值，根据每组标准物质浓度与测得的吸光度值之间的关系绘制标准对应关系曲线；所述的MBTH溶液是由MBTH配制而成的水溶液；所述酸性铁试剂是由可溶性Fe
3+
盐和强酸配制而成的水溶液；(3)向步骤a中的酪蛋白溶液Ⅰ中加入蛋白酶溶液，保证所得溶液中酪蛋白浓度与步骤b中酪蛋白溶液Ⅱ中酪蛋白浓度相同，进行酶解反应得到酶解液，在酶解液中加入三氯乙酸溶液以终止酶解反应，充分混匀，离心或过滤，得到酪蛋白酶解液的上清液，该上清液中三氯乙酸的浓度与酪蛋白溶液Ⅱ中三氯乙酸的浓度相同；(4)制备酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：张永勤，刘建瑞，刘银春，董静文，刘芳，邬雅喃，陈相玉，张凤国，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：