一种小分子化合物在制备抗SARS-CoV-2感染药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种结构如下式所示的小分子化合物在制备抗SARS

【技术实现步骤摘要】
感染药物的潜力，从而为开发抑制SARS
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CoV
‑
2感染的药物提供新方案。
[0011]更详尽的技术方案参见具体实施方法。
附图说明
[0012]图1：SARS
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CoV
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2 3Clpro蛋白酶活性检测结果。
[0013]图2：化合物对SARS
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CoV
‑
2 3CLpro的抑制作用。
[0014]图3：化合物对SARS
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CoV
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2 3CLpro的半数有效抑制浓度(IC
50
)。
[0015]图4：化合物对SARS
‑
CoV
‑
2的半数抑制浓度(IC
50
)。
[0016]图5：化合物对Vero E6细胞的半数毒性浓度(CC
50
)。
具体实施方式
[0017]下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。
[0018]关键材料说明及来源：
[0019]pET30a
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3CLpro重组质粒：根据NCBI网站3CLpro基因编码区序列设计特异性引物，扩增SARS
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CoV
‑
2 3CLpro片段，原核表达pET30a载体而得到。该质粒由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。
[0020]SARS
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CoV
‑
2(Omicron)株：由中科院武汉病毒研究所提供。
[0021]Vero E6细胞(非洲绿猴肾细胞)：从中国科学院细胞库购买。
[0022]阳性对照蛋白PC：从碧云天生物技术有限公司购买。
[0023]依布硒(Ebselen)：从碧云天生物技术有限公司购买。
[0024]化合物：申请人团队合成。
[0025]实施例1
[0026]1.3Clpro蛋白的制备
[0027]按常规方法，将pET30a
‑
3CLpro重组质粒转化E.coli BL
‑
21中表达，进行蛋白纯化及鉴定，具体操作如下：
[0028]①
质粒转化E.coli BL
‑
21感受态细胞，挑选单个菌落10ml LB液体培养基 (pET30a
‑
3CLpro为Kan
+
)，37℃，200rpm的摇床中继续振荡培养过夜。
[0029]②
次日按停摇床，取1mL菌液加入到乘有新鲜的500mL LB液体培养基 (pET30a
‑
3CLpro为Kan
+
)的摇菌管中，按上一步处理包好盖子后再次放入37℃， 200rpm摇床中振荡培养，计时器计时每0.5h测一次菌液OD(600nm)值，当其约等于0.6时关闭摇床，吸取1ml菌液于干净的1.5ml离心管中，超声标记为A(诱导蛋白表达前的细菌悬液)，低温中储存。
[0030]③
按照IPTG终浓度为0.1mmol/L的比例计算好向步骤
②
中菌液加入已配置好的20％ IPTG液体的体积，即20μl，然后按上一步方法包好盖子后置于模式设置为18℃、 200rpm的恒温摇床中继续培养6h后吸菌液于干净的10ml离心管中超声标记为B(诱导蛋白表达后的细菌悬液)，4℃冰箱中备用。剩余的菌液用于下一步。
[0031]④
将上一步获得的已诱导表达的菌液置于设置4℃、12000rpm的低温高速离心机中离心10min后吸取上清液转移到插在冰盒中、已做好标记的无菌1.5ml离心管中标记为C(诱导蛋白表达后的上清)，尽量沥干水分后从沉淀物中挑取适量细菌沉淀于干净的、含有1ml PBS液体的1.5ml离心管中混匀，标记为D(诱导蛋白表达后的菌体沉淀)， 4℃冰箱中备
用。将ABCD用SDS
‑
PAGE和Western Blot分析验证。
[0032]⑤
取出步骤
③
中剩余的菌液超声，4℃、12000rpm的低温高速离心机中离心10min 后吸取上清液，镍柱亲和层析纯化，超滤，BCA法测定蛋白浓度。
[0033]2.蛋白酶的活性检测
[0034]试验步骤如下：
[0035]①
先将96孔板于冰上预冷，吸取纯化的SARS
‑
CoV
‑
2 3CLpro(3CLpro)80uL加入 292uL灭菌水预稀释，吸取阳性对照蛋白(PC)4uL加入368uL灭菌水预稀释。
[0036]②
预冷的96孔板A1孔：依次加入灭菌水93uL，DMSO 5uL；
[0037]A2孔：依次加入阳性蛋白对照预稀释液93uL，DMSO 5uL；
[0038]A3孔：依次加入阳性蛋白对照预稀释液93uL，阳性抑制剂(Ebselen，10uM)5uL；
[0039]A4孔：依次加入阳性蛋白对照预稀释液93uL，阳性抑制剂(Ebselen，2uM)5uL；
[0040]A5孔：依次加入阳性蛋白对照预稀释液93uL，DMSO 5uL；
[0041]A6孔：依次加入纯化的SARS
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CoV
‑
2 3CLpro预稀释液93uL，阳性抑制剂(Ebselen， 10uM)5uL；
[0042]A7孔：依次加入纯化的SARS
‑
CoV
‑
2 3CLpro预稀释液93uL，阳性抑制剂(Ebselen， 2uM)5uL。
[0043]③
同时在A1
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A7孔中加入2uL冠状病毒主蛋白酶荧光底物，放于37℃孵育箱 5min，最后将96孔板于多功能酶标仪上检测。
[0044]结果显示：纯化的3CLpro与阳性对照PC有相似的荧光强度曲线，再加入阳性抑制剂(Ebselen)后这一变化被抑制(图1)。说明纯化的SARS
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CoV
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2 3CLpro具有活性。
[0045]3.化合物对SARS
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CoV
‑
2 3Clpro的抑制试验
[0046]为了鉴定化合物是否可以抑制SARS
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CoV
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2 3CLpro活性，使用化合物与 SARS
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CoV
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2 3CLpro共孵育检测其活性变化。具体操作如下：
[0047]①
先将96孔板于冰上预冷，吸取纯化的SARS
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CoV
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2 3CLpro 60uL加入219uL灭菌水预稀释。
[0048]②
预冷的96孔板A1孔：依次加入灭菌水93uL，DMSO 5uL；
[0049]A2孔：纯化的SARS
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小分子化合物在制备抗SARS
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CoV
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【专利技术属性】
技术研发人员：孙宾莲，舒细记，龚睿，贺贤然，乔嘉璐，王承海，孙攀，刘钰晨，柳威，李卫玲，彭倩，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所深圳福山生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：