含I型聚酮合酶基因的质粒的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种制备包含编码PKS的DNA在内的质粒的方法，其包括以下工序：在枯草芽孢杆菌感受态细胞中导入包含编码I型聚酮合酶(PKS)的DNA串联重复序列在内的DNA构建体的工序。序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】含I型聚酮合酶基因的质粒的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种含I型聚酮合酶(PKS)基因的质粒的制方法。

技术介绍

[0002]已知由放线菌和丝状菌等微生物产生的天然化合物是具有多种结构和生物活性的有用物质。目前，通过解读基因组，可以很容易地确定用于生物合成有用物质的基因簇。此外，还明确了存在大量用于生物合成人类未利用的有用物质的基因簇。在微生物的次级代谢产物中，重要研究了用于对具有产业重要性的聚酮类化合物和肽类化合物进行生物合成的基因簇。例如，可以列举出I型聚酮合酶(PolyKetideSynthase；PKS)，其用于在放线菌产生的二级代谢产物中临床应用的erythromycin、FK
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506(tacrolimus)、rapamycin及avermectin等大环内酯类化合物的生物合成。
[0003]考虑到通过传统的化学方法生产聚酮化合物等的难度、以及野生型细胞中的聚酮通常的低生产性，寻找用于生产聚酮化合物的改良或替代方法成为备受瞩目的焦点。由于这些原因，通过将生物合成所需的基因簇从原始菌株引入到其他细胞中来尝试化合物的异源生产。实际上，异源表达的传统方法大多限定于小的基因簇(＜40kb)，而很多PKS基因簇都比它大得多，其为从数千碱基到100千碱基以上的DNA。
[0004]作为组装DNA的方法，已知有金门(Golden Gate)法、吉布森(Gibson)法等连接多个DNA片段的方法(非专利文献1)。
[0005]Golden Gate法是准备一个或两个末端包含由IIs型限制性核酸内切酶识别的碱基序列的多个DNA片段，并用IIs型限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行处理的方法。可以通过由IIs型限制性核酸内切酶切割产生的粘性末端(sticky end)，来使多个DNA片段杂交，接着利用DNA连接酶连接缺口，来制造出具有所需碱基序列的DNA片段。通过设计由IIs型限制性核酸内切酶识别的碱基序列的类型和排列，可以将由IIs型限制性核酸内切酶切割的多个DNA片段连接起来以使限制性核酸内切酶的识别位点消除，从而制造出具有所需碱基序列的DNA片段。报告了一种通过利用Golden Gate法来将具有所需碱基序列的DNA片段导入克隆载体的方法等(专利文献1和非专利文献1)。
[0006]Gibson法是准备以相邻连接的DNA片段的各自末端部的连接区域重叠15～80个碱基对(bp)左右的方式(以成为相同碱基序列的方式)进行设计的多个DNA片段，用5'核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶进行处理的方法。通过5'核酸外切酶从DNA片段末端部分地产生单链DNA。所产生的单链DNA在重复的碱基序列部分中杂交。然后，通过DNA聚合酶填充间隙，并通过DNA连接酶来连接缺口，从而可以制造出具有所需碱基序列的DNA片段。
[0007]在Gibson法中，由于不需要包含由限制性核酸内切酶识别的碱基序列等，因此没有碱基序列的限制，并且也适用于长DNA片段的构建(非专利文献2、专利文献2以及专利文献3)。
[0008]现有技术文献
[0009]专利文献
[0010]专利文献1：美国专利申请公开第2010/0291633号说明书
[0011]专利文献2：美国专利第7723077号说明书
[0012]专利文献3：日本特表2011
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512140号公报
[0013]非专利文献
[0014]非专利文献1:PLoS One,2009年，4(5),e5553
[0015]非专利文献2:化学和生物，2016年，Vol.54,No.10,pp.740～746

技术实现思路

[0016]专利技术所要解决的问题
[0017]据说在Golden Gate法中，可一次性连接的DNA片段的数量约为20左右，如果超过该数量，效率会降低。如PKS基因簇这样的序列是重复序列及GC含量高的碱基序列，因此错误连接的频率存在提高的倾向，因此很难一次性地准确连接多个DNA片段。
[0018]在Gibson法中，当组装包含重复序列或GC含量高的碱基序列的PKS基因簇的情况下，由于单链DNA杂交的准确性降低，因此错误连接的频率会变得极高。实际上，其受限于最多15个片段的组装规模。
[0019]本专利技术的目的在于高效地合成聚酮合酶基因。
[0020]用于解决问题的方法
[0021]本专利技术提供一种包含以下I型聚酮合酶基因的质粒及其制备方法、制备PKS酶的方法。
[0022]〔1〕一种制备包含编码PKS的DNA在内的质粒的方法，其包括以下工序：在枯草芽孢杆菌感受态细胞中导入包含编码I型聚酮合酶(PKS)的DNA串联重复序列在内的DNA构建体的工序。
[0023]〔2〕根据〔1〕所述的方法，其包括以下工序：通过用TypeII限制性核酸内切酶切割多个DNA片段前体，来制备两端具有粘性末端的多个DNA片段的工序；通过连接多个所述DNA片段，来制备所述DNA构建体的工序。
[0024]〔3〕根据〔2〕所述的方法，其包括以下工序：通过将包含不同种类的多个所述DNA片段的溶液进行混合以使得各溶液中的DNA片段的摩尔浓度比为0.8～1.2，来制备编码I型聚酮合酶(PKS)的DNA串联重复序列的工序。
[0025]〔4〕根据〔2〕或〔3〕所述的方法，其中，所述DNA片段前体的GC含量为65％以下。
[0026]〔5〕根据〔1〕至〔4〕中任一项所述的方法，其中，所述导入工序是将所述DNA构建体与枯草芽孢杆菌感受态细胞共培养的工序。
[0027]〔6〕根据〔1〕至〔5〕中任一项所述的方法，其中，其还包括从导入了所述DNA构建体的枯草芽孢杆菌中回收质粒DNA的工序。
[0028]〔7〕一种包含编码I型聚酮合酶(PKS)的DNA在内的质粒，其中，其通过根据〔1〕至〔6〕中任一项所述的方法而得到。
[0029]〔8〕一种制备PKS酶的方法，其包括以下工序：用质粒转化宿主细胞的工序；培养转化后的所述宿主细胞的工序；其中，所述质粒是通过根据〔1〕至〔6〕中任一项所述的方法而得到的、且包含编码I型聚酮合酶(PKS)的DNA在内的质粒。
[0030]〔9〕根据〔8〕所述的方法，其中，所述宿主细胞是Streptomyces属细菌。
[0031]专利技术效果
[0032]可以提供一种准确且有效地对编码如PKS这样的巨大基因簇的长链DNA进行组装的方法。
附图说明
[0033]图1是示出连接3个DEBS PKS基因编码序列，并在其各自的前面插入启动子、RBS，而在其后面插入终止子序列的靶序列的概略图。
[0034]图2示出了在使用大肠杆菌的比较例1中得到的质粒所包含的PKS基因的限制性核酸内切酶降解产物的电泳结果。
[0035]图3示出了在使用枯草芽孢杆菌的实施例1中得到的质粒所包含的PKS基因的限制性核酸内切酶降解产物的电泳结果。图3中的检查示出了获得所需的D本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制备包含编码PKS的DNA在内的质粒的方法，其包括以下工序：在枯草芽孢杆菌感受态细胞中导入包含编码I型聚酮合酶(PKS)的DNA串联重复序列在内的DNA构建体的工序。2.根据权利要求1所述的方法，其包括以下工序：通过用TypeII限制性核酸内切酶切割多个DNA片段前体，来制备两端具有粘性末端的多个DNA片段的工序；通过连接多个所述DNA片段，来制备所述DNA构建体的工序。3.根据权利要求2所述的方法，其包括以下工序：通过将包含不同种类的多个所述DNA片段的溶液进行混合以使得各溶液中的DNA片段的摩尔浓度比为0.8～1.2，来制备编码I型聚酮合酶(PKS)的DNA串联重复序列的工序。4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述DNA片段前体的GC含量为65...

【专利技术属性】
技术研发人员：大卫，
申请(专利权)人：丝芭博株式会社，
类型：发明
国别省市：