一种角膜脱细胞方法技术

本发明专利技术解决了现有角膜脱细胞技术对角膜胶原结构的破坏或者仍留有较大免疫原性的问题，提出了一种角膜脱细胞方法，既能够降低角膜基质的免疫原性，又保留了角膜基质的正常胶原结构，一种角膜脱细胞方法，其特征在于，包括：S1：取新鲜动物角膜，并置于混合保存液中；S2：向S1的溶液中加入脱细胞试剂，震荡反应；S3：继续向S2的溶液中加入表面活性剂，震荡反应；S4：取出反应后的角膜，用混合保存液震荡漂洗；其中，所述的混合保存液的构成如下：0.9％生理盐水或10mmol/L磷酸盐缓冲液、5

【技术实现步骤摘要】
一种角膜脱细胞方法


[0001]本专利技术涉及生物材料
，具体涉及一种角膜脱细胞方法。

技术介绍

[0002]角膜病是全球范围内第二致盲眼病，且近年来呈不断增长的趋势。目前 治疗角膜盲最为有效的方式是异体角膜移植，然而异体角膜来源的缺乏造成 大量患者得不到及时治疗而最终失明。异种角膜如猪等动物的角膜基质具有 与人角膜基质类似的组织结构、生物物理特性和光学特性，但异种移植后强 烈的排斥反应阻碍了异种角膜在临床上的应用。近年来的研究发现，角膜基 质内的基质细胞是引起基质型排斥反应的主要抗原，而作为角膜基质架构的 胶原纤维在种系间高度一致，抗原性很低，去细胞的异种角膜移植后不产生 排斥反应。因此，将动物的基质细胞完全脱去，使之成为去细胞的角膜基质 可能是人角膜基质的理想替代物。
[0003]现有技术生产的去细胞角膜基质在脱细胞过程中，主要采用的是胰酶联 合表面活性剂，此类方法虽然能去除细胞成分，但反应剧烈，对角膜基质破 坏严重，其中使用胰酶处理易导致角膜基质降解，对天然角膜的胶原微结构 和糖胺聚糖成分破坏严重，致使处理后的角膜丧失了天然角膜大部分的组织 特性，移植后与组织融合效果较差，无法达到治疗目的。公开号为 CN104001217A的专利申请公开了一种通过反复改变渗透压对角膜进行脱细 胞的方法，但该方法无法完全去除细胞碎片，且透光性有所降低。

技术实现思路

[0004]本专利技术解决了现有角膜脱细胞技术对角膜胶原结构的破坏或者仍留有较 大免疫原性的问题，提出了一种角膜脱细胞方法，既能够降低角膜基质的免 疫原性，又保留了角膜基质的正常胶原结构。
[0005]本专利技术提供了一种角膜脱细胞方法，其特征在于，包括：
[0006]S1：取新鲜动物角膜，并置于混合保存液中；
[0007]S2：向S1的溶液中加入脱细胞试剂，震荡反应；
[0008]S3：继续向S2的溶液中加入表面活性剂，震荡反应；
[0009]S4：取出反应后的角膜，用混合保存液震荡漂洗；
[0010]其中，所述的混合保存液的构成如下：0.9％生理盐水或10mmol/L磷酸盐 缓冲液、5
‑
50g/L的透明质酸、10
‑
70g/L的硫酸软骨素、5
‑
10mg/L的链霉素、 5
‑
10mg/L的青霉素、5
‑
10mg/L的基质降解抑制剂、以及余量的超纯水；脱细 胞试剂中包括以下一种或多种的磷脂酶：A1、A2、B1、B2、C、D。
[0011]进一步的，所述的动物角膜的来源包括：猪、羊、兔、牛。
[0012]进一步的，所述的基质降解抑制剂包括：酪氨酸类似物、黄酰胺类、羧 酸类、多西霉素。
[0013]进一步地，所述的磷脂酶的浓度范围为1
‑
5000U/mL，处理时间为3
‑
48h， 处理温度
为4
‑
56℃，震荡频率为50
‑
100rpm。
[0014]进一步地，所述的脱细胞试剂中还包括质量百分浓度0.1
‑
2％脱细胞表面 活性剂，具体可以选择以下的一种或多种：胆酸盐、脱氧胆酸盐、鹅脱氧胆 酸盐、甘氨酸胆酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、牛磺鹅脱氧胆酸盐、 脂多糖、脂蛋白、溶血磷脂。
[0015]进一步地，所述的表面活性剂包括以下的一种或多种：Triton X
‑
100、TritonX
‑
200、脱氧胆酸钠、十二烷基磺酸钠、CHAPS。
[0016]进一步地，所述的表面活性剂的使用时间为4
‑
36小时，处理温度为4
‑
20℃， 震荡频率为50
‑
100rpm，表面活性剂使用的具体浓度是：Triton X
‑
100的浓度为 1
‑
5％，TritonX
‑
200的浓度为1
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5％，脱氧胆酸钠的浓度为2
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6％，十二烷基磺 酸钠的浓度为0.05
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5％，CHAPS的浓度为5
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10％。
[0017]进一步地，所述的漂洗方法是：漂洗时间为2
‑
10h，每隔1h换一次漂洗液， 漂洗温度为4
‑
20℃，震荡频率为50
‑
100rpm。
[0018]本专利技术的有益效果如下：
[0019](1)脱细胞全程使用了混合保存液，该保存液能够保护角膜胶原结构和 维持良好透光率，可有效降低对角膜胶原结构的破坏；
[0020](2)磷脂酶是一种高活性的、特异性的水解磷脂键的酶，采用磷脂酶进 行脱细胞处理，特异性强，对细胞外基质中的结构和功能没有损伤作用。
具体实施方式
[0021]为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面将对本专利技术实施 例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发 明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域 普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获的的所有其他实施例，都应 当属于本专利技术保护的范围。
[0022]实施例1
[0023](1)常规无菌操作下，用10.0mm环钻取下新鲜猪角膜，将猪角膜放入混 合保护液中，恒温4℃漂洗三次，每次30min，震荡频率为100rpm，混合保护 液地配方如下：0.9％生理盐水，透明质酸的浓度为20g/L，硫酸软骨素的浓度 为50g/L，链霉素5mg/L，青霉素5mg/L，多西霉素8mg/mL，其余部分为超纯 水；
[0024](2)在放有猪角膜地混合保护液中加入0.5％脱氧胆酸钠和500U/mL磷脂 酶A2，在37℃温度下震荡处理6h，震荡频率为70rpm；
[0025](3)将步骤(2)用酶处理后的角膜用混合保护液4℃漂洗三次，每次 30min，震荡频率为100rpm。将漂洗后的角膜置于含有2％Triton X
‑
100的混 合保护液中，4℃震荡处理24h，震荡频率为70rpm；
[0026](4)将步骤(3)处理后的角膜用4℃混合保护液漂洗6h，每隔1h换液， 震荡频率为100rpm。
[0027]将本实施例制得的脱细胞角膜进行组织学观察和透光率测定。组织学观 察结果表示角膜胶原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，无细胞残留，角膜基质 的板层结构保留完整。在390nm
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780nm波长范围内，角膜透光率在82％
‑
93％ 之间，透光率较高，透明度较好。
[0028]实施例2
[0029]按照实施例1的方法，不同的是，混合保护液成份为0.9％生理盐水。
[0030]将本实施例制得的脱细胞角膜进行组织学观察和透光率测定。组织学观 察结果表示角膜胶原纤维排列混乱，孔隙不均匀，无细胞残留，角膜基质的 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种角膜脱细胞方法，其特征在于，包括：S1：取新鲜动物角膜，并置于混合保存液中；S2：向S1的溶液中加入脱细胞试剂，震荡反应；S3：继续向S2的溶液中加入表面活性剂，震荡反应；S4：取出反应后的角膜，用混合保存液震荡漂洗；其中，所述的混合保存液的构成如下：0.9％生理盐水或10mmol/L磷酸盐缓冲液、5
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50g/L的透明质酸、10
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70g/L的硫酸软骨素、5
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10mg/L的链霉素、5
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10mg/L的青霉素、5
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10mg/L的基质降解抑制剂、以及余量的超纯水；脱细胞试剂中包括以下一种或多种的磷脂酶：A1、A2、B1、B2、C、D。2.根据权利要求1所述的角膜脱细胞方法，其特征在于，所述的动物角膜的来源包括：猪、羊、兔、牛。3.根据权利要求1所述的角膜脱细胞方法，其特征在于，所述的基质降解抑制剂包括：酪氨酸类似物、黄酰胺类、羧酸类、多西霉素。4.根据权利要求1所述的角膜脱细胞方法，其特征在于，所述的磷脂酶的浓度范围为1
‑
5000U/mL，处理时间为3
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48h，处理温度为4
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56℃，震荡频率为50
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100rpm。5.根据权利要求1所述的角膜脱细胞方法，其特征在于，所述的脱细胞试剂中还包括质量百分浓度0.1
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈诗浩，杨习锋，曾晨光，
申请(专利权)人：广州新诚生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：