用于核酸检测的高重指导池化制造技术

在某些实施方案中，本文提供了使用可编程核酸酶检测样品中多种靶核酸或样品中靶核酸的多种区段的各种方法、试剂和装置。在某些实施方案中，本公开提供了指导核酸、可编程核酸酶和检测核酸的池的组合物以及使用所述组合物检测样品中一种靶核酸的不同区段或不同靶核酸的方法。核酸的方法。核酸的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】NO:28具有至少60％的序列同一性。
[0010]在一些方面，可编程核酸酶是Cas14酶。在进一步的方面，Cas14酶是Cas14a、Cas14b、Cas14c、Cas14d、Cas14e、Cas14f、Cas14g或Cas14h。
[0011]在其他方面，可编程核酸酶包含至少两个HEPN结构域。在进一步的方面，可编程核酸酶是VI型Cas酶。在更进一步的方面，可编程核酸酶是Cas13酶。在更进一步的方面，Cas13酶是Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d或Cas13e。
[0012]在一些方面，靶核酸是DNA。在其他方面，靶核酸是RNA。在一些方面，组合物还包含靶核酸。在一些方面，靶核酸包含不同的靶核酸。
[0013]在多个方面，本公开提供了一种测定样品中的靶核酸的区段的方法，该方法包括：使样品与如权利要求1
‑
30中任一项的组合物接触；以及测定由检测核酸的切割产生的信号。
[0014]在一些方面，该方法还包括逆转录靶核酸，扩增靶核酸，体外转录靶核酸或它们的任何组合。在一些方面，扩增是等温扩增。
[0015]以引用的方式并入
[0016]本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请以引用的方式并入本文，就如每个单独的公布、专利或专利申请被具体地和单独地指出以引用的方式并入的程度一样。就以引用方式并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容相矛盾而言，说明书意图取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。
附图说明
[0017]专利或申请文件包含至少一张彩色绘制的图。带有彩图的本专利或专利申请出版物的副本将在提出请求和支付必要费用之后由专利局提供。在所附权利要求中具体阐述了本公开的新颖特征。通过参考以下阐述说明性实施方案的详细描述和附图将获得对本公开的特征和优点的更好理解，在这些说明性实施方案中利用了本公开的原理，在附图中：
[0018]图1描绘了与可编程核酸酶1:1复合的不同指导核酸的池。
[0019]图2示出了使用LbCas12a可编程核酸酶(SEQ ID NO:18)的多重DETECTR反应随时间变化的原始荧光。每个多重DETECTR反应都用两种不同指导RNA序列进行。在每个反应中，第一指导核酸序列以第二指导核酸序列的19倍、49倍或99倍的浓度存在，以分别模拟20重、50重或100重高重DETECTR反应。在每个反应中使用在5'端用FAM标记并且在3'端用Iowa Black FQ标记的具有SEQ ID NO:9的序列的8核苷酸单链DNA检测核酸。
[0020]图2A示出了第一组多重DETECTR反应，其中靶向人β
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珠蛋白基因的指导RNA(SEQ ID NO:172)以靶向人RNase P基因的指导RNA(SEQ ID NO:171)的19倍(“20重”)、49倍(“50重”)或99倍(“100重”)的浓度存在。池化的指导RNA用于检测对应于人RNase P基因的扩增区段(SEQ ID NO:173，顶行)或人β
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珠蛋白基因的扩增区段(SEQ ID NO:174，底行)的双链DNA靶核酸的存在或不存在。每个多重DETECTR反应在0pM、10pM、100pM或1000pM靶核酸的存在下进行。
[0021]图2B示出了第二组多重DETECTR反应，其中靶向人RNAase P基因的指导RNA(SEQ ID NO:171)以靶向人β
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珠蛋白基因的指导RNA(SEQ ID NO:172)的19倍(“20重”)、49倍(“50重”)或99倍(“100重”)的浓度存在。池化的指导RNA用于检测对应于人RNase P基因的扩增
区段(SEQ ID NO:173，顶行)或人β
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珠蛋白基因的扩增区段(SEQ ID NO:174，底行)的双链DNA靶核酸的存在或不存在。每个多重DETECTR反应在0pM、10pM、100pM或1000pM靶核酸的存在下进行。
[0022]图3示出了图2的随时间变化的原始荧光数据。每个光谱是单独的DETECTR反应的结果，其中时间(跨越大约90分钟)作为x轴，原始荧光产量在y轴。所有光谱都以相同的比例显示。空白光谱表明未进行反应。
[0023]图4示出了使用LbCas12a可编程核酸酶(SEQ ID NO:18，虚线)和Cas12变体可编程核酸酶(SEQ ID NO:28，实线)的高重DETECTR反应随时间变化的原始荧光。在阴性基质中稀释10倍(“稀释
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1”)、102倍(“稀释
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2”)、103倍(“稀释
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3”)、104倍(“稀释
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4”)、105倍(“稀释
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5”)、106倍(“稀释
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6”)或107倍(“稀释
‑
7”)并进行PCR扩增的疏螺旋体培养物中，使用20种不同指导核酸序列的指导RNA池检测靶核酸的存在或不存在。在检测之前对稀释的疏螺旋体培养物进行PCR扩增以扩增16S基因。将阴性血浆(“NegPlasma”)、含有铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、枯草乳杆菌(Lactobacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)的Zymo标准品(“Zymo”)和水(“H2O
’
)作为阴性对照进行了测试。
[0024]图5示出了图4所示的高重DETECTR反应的最大荧光速率。每个条件下的左边的柱对应于使用Cas12变体可编程核酸酶(SEQ ID NO:28)的反应，右边的柱对应于使用LbCas12a可编程核酸酶(SEQ ID NO:18)的反应。
[0025]图6示出了图4和图5所示的高重DETECTR反应产生结果的时间。每个条件下的左边的柱对应于使用Cas12变体可编程核酸酶(SEQ ID NO:28)的反应，右边的柱对应于使用LbCas12a可编程核酸酶(SEQ ID NO:18)的反应。产生结果的时间较短表明DETECTR反应呈阳性。
[0026]图7示出了使用Cas12可编程核酸酶(SEQ ID NO:18)的多重DETECTR反应随时间变化的原始荧光。使用四种不同的指导RNA序列，即导向包含人RNase P基因(SEQ ID NO:172)的靶核酸区段的第一种指导核酸以及三种脱靶指导序列进行多重DETECTR反应。脱靶指导核酸序列池以第一指导核酸序列的499倍或999倍存在，以分别模拟500重和1000重DETECTR反应。另外，还在不存在脱靶指导核酸的情况下进行单重测定。在每个反应中使用在5'端用FAM标记并且在3'端用Iowa Black FQ标记的具有SEQ ID NO:9的序列的8核苷酸单链DNA检测核酸。
[0027]图8示出了图7的随时间变化的原始荧光数据。每个光谱是单独的DET本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种组合物，所述组合物包含可编程核酸酶和包含大于20种不同指导核酸序列的指导核酸池，其中所述池中的至少一种指导核酸与靶核酸的区段杂交。2.如权利要求1所述的组合物，其中所述指导核酸池包含至少50种不同指导核酸序列、至少100种不同指导核酸序列、至少500种不同指导核酸序列或至少1000种不同指导核酸序列。3.如权利要求1
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2中任一项所述的组合物，其中所述指导核酸池包含与所述靶核酸的不同区段杂交的至少两种指导核酸。4.如权利要求1
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3中任一项所述的组合物，其中所述指导核酸池中的指导核酸具有选自一组对应于所述靶核酸的核酸的平铺指导核酸的序列。5.如权利要求4所述的组合物，其中：a)所述平铺指导核酸在与所述靶核酸杂交时沿着所述靶核酸是连续的；b)所述平铺指导核酸在与所述靶核酸杂交时沿着所述靶核酸是不连续的；c)所述平铺指导核酸在与所述靶核酸杂交时沿着所述靶核酸重叠；或者d)它们的任何组合。6.如权利要求1
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5中任一项所述的组合物，其中所述靶核酸来自病原体。7.如权利要求1
‑
2中任一项所述的组合物，其中所述指导核酸池中的至少两种指导核酸与不同靶核酸的区段杂交。8.如权利要求7所述的组合物，其中所述不同靶核酸中的至少两种靶核酸来自不同病原体。9.如权利要求6或权利要求8所述的组合物，其中所述病原体是病毒、细菌、真菌、原生动物或蠕虫。10.如权利要求1
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9中任一项所述的组合物，其中所述指导核酸池中的指导核酸与来自金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、艰难梭菌、大肠杆菌、结核分枝杆菌或军团菌属的区段杂交。11.如权利要求1
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10中任一项所述的组合物，其中所述指导核酸池中的至少两种指导核酸彼此相差至少一个碱基。12.如权利要求1
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11中任一项所述的组合物，其中所述指导核酸池的总浓度为约400nM、约1000nM(1μM)或约2000nM(2μM)。13.如权利要求1
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12中任一项所述的组合物，其中所述指导核酸池中的每种指导核酸包含20至50个碱基。14.如权利要求13所述的组合物，其中每种指导核酸包含30至50个碱基。15.如权利要求1
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14中任一项所述的组合物，其中所述可编程核酸酶是V型CRISPR
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Cas酶。16.如权利要求1
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15中...

【专利技术属性】
技术研发人员：马修，
申请(专利权)人：猛犸生物科学公司，
类型：发明
国别省市：