一种测定线粒体能量代谢组的方法技术

本发明专利技术公开了一种测定线粒体能量代谢组的方法。该方法基于线粒体能量代谢的相关途径，构建了线粒体能量代谢组，并采用N,N

【技术实现步骤摘要】
一种测定线粒体能量代谢组的方法


[0001]本专利技术属于分析化学
，具体涉及一种衍生化结合超高效液相色谱
‑
串联质谱测定线粒体能量代谢组的方法。

技术介绍

[0002]线粒体是重要的生物能量和生物合成的细胞器，对维持正常细胞功能和人类健康至关重要。线粒体是代谢反应的枢纽，与多种代谢途径相关，包括糖代谢(三羧酸循环和糖酵解)、氨基酸代谢、脂肪酸代谢和核苷酸代谢。线粒体功能障碍会引起多种疾病，并且恶性肿瘤的一个重要标志就是代谢重编程，线粒体通过多种机制驱动这种重编程。因此，为了更好的研究线粒体代谢与各种疾病的关系，建立一种能同时检测多种线粒体代谢物的高灵敏度的分析方法是迫在眉睫的。
[0003]LC
‑
MS/MS法的高选择性、特异性和灵敏度等优势，已经使它成为代谢组学最主要的检测方法。线粒体代谢物大部分是水溶性的代谢物，包括小分子有机酸、氨基酸和核苷酸等。这些代谢物极性较大，在反相色谱柱上保留效果差，目前采用的方法有：添加离子对试剂来改善保留，但是该方法容易污染质谱；采用亲水相互作用色谱法(HILIC)，对极性化合物有较好的保留，但是方法优化复杂；还可以采用衍生化的方法，引入疏水基团，改善保留，同时还可以引入质谱增敏基团，提高质谱响应。
[0004]综上所述，开发一种基于衍生化的LC
‑
MS方法，能简单、高效、高选择性和高灵敏度地检测线粒体代谢物具有重要价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种衍生化结合LC<br/>‑
MS测定线粒体能量代谢组的方法，通过采用衍生化试剂，能实现同时检测多种线粒体代谢物，并提高其色谱保留和质谱响应。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]一种测定线粒体能量代谢组的方法，包括以下步骤：
[0008]步骤1，衍生化方法：取细胞或组织的代谢提取物，然后依次加入10
‑
50mM N,N
‑
二甲基对苯二胺溶液、5
‑
30mM 1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和0.5
‑
10mM咪唑溶液，混匀后在30
‑
60℃水浴中反应10
‑
120min；
[0009]步骤2，衍生化产物的纯化：向反应溶液中加入水和乙酸乙酯的混合溶液进行萃取，13000rpm、4℃、离心5min，吸取水层，氮吹至干，3％乙腈水溶液复溶，加入内标溶液；
[0010]步骤3，将步骤2得到的溶液，利用超高效液相色谱
‑
串联质谱进样检测，通过标准曲线计算得到各代谢物含量；
[0011]所述超高效液相色谱
‑
串联质谱的检测条件如下：
[0012]色谱柱：CORTECS UPLC T3 Column，规格为2.1
×
150mm、1.6μm；柱温：45℃；进样量：2μL；流速：0.2mL/min；流动相组成：流动相A：10mM甲酸铵的水溶液；流动相B：乙腈；采用梯度洗脱的方式，洗脱条件如下表：
[0013][0014]质谱条件：多反应监测模式，ESI离子源，采用正电喷雾离子模式操作，采用的参数如下：干燥气体值，110；雾化器气体值，180；电喷雾电压，5500V；离子源温度，400℃。
[0015]进一步地，所述线粒体代谢物包括琥珀酸，α
‑
酮戊二酸，苹果酸，延胡索酸，柠檬酸，2
‑
羟基戊二酸，草酰乙酸，顺乌头酸，乳酸，肌酸，天冬氨酸，天冬酰胺，丙氨酸，脯氨酸，单磷酸腺苷，三磷酸腺苷，胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核苷酸，肉碱，乙酰肉碱，丙酰基肉碱，甜菜碱，二氢乳清酸。
[0016]进一步地，N,N
‑
二甲基对苯二胺溶液的浓度为40mM，1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度为10mM，咪唑的浓度为1mM。
[0017]在本专利技术的一个实施例中，细胞或组织的代谢提取物、N,N
‑
二甲基对苯二胺溶液、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和咪唑溶液的体积比为1：1：1：2。
[0018]进一步地，步骤1中混匀后在50℃水浴中反应90min。
[0019]本专利技术具有以下优点和有益效果：
[0020](1)本专利技术的定量方法涵盖了线粒体能量代谢相关的多种代谢物，可以进一步研究线粒体代谢改变与各种疾病的关系。
[0021](2)本专利技术首次使用N,N
‑
二甲基对苯二胺作为衍生化试剂对线粒体代谢物的羧基位点进行衍生化，衍生化反应条件简单、温和、快速、环境友好，衍生步骤简单。
[0022](3)本专利技术的定量方法基于高灵敏度的三重四级杆质谱仪，分析速度快，定量下限低，可以最大程度的满足样本中相关代谢物的检测。
[0023](4)该方法下衍生化产物引入疏水性基团，提高了极性较大的水溶性代谢物在反相色谱柱上的保留，并且引入的基团提高了代谢物在质谱中测的灵敏度。
附图说明
[0024]图1为衍生后的琥珀酸、乳酸、丙氨酸和单腺苷磷酸的离子碎片图，其中，a为琥珀酸，b为乳酸，c为丙氨酸，d为单腺苷磷酸。
[0025]图2
‑
图6为衍生化温度、衍生化时间、DMPD浓度、EDC浓度和咪唑缓冲浓度优化的结果。
[0026]图7为衍生化后线粒体能量代谢组标准品多反应监测提取离子流色谱图。其中：1
‑
三磷酸腺苷、2
‑
柠檬酸、3
‑
天冬酰胺、4
‑
尿嘧啶核苷酸、5
‑
胞嘧啶核苷酸、6
‑
单磷酸腺苷、7
‑
天冬氨酸、8
‑
苹果酸、9
‑
顺式乌头酸、10
‑
琥珀酸、11
‑2‑
羟基戊二酸、12
‑
丙氨酸、13
‑
延胡索酸、14
‑
甜菜碱、15
‑
肉碱、16
‑
肌酸、17
‑
α
‑
酮戊二酸、18
‑
二氢乳清酸、19
‑
乙酰肉碱、20
‑
乳酸、21
‑
丙酰基肉碱、22
‑
脯氨酸、23
‑
草酰乙酸。
[0027]图8为HCT 116细胞鱼藤酮给药处理后线粒体能量代谢组的代谢物含量变化结果。
具体实施方式
[0028]下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细说明，但不应理解为对本专利技术的限本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定线粒体能量代谢组的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1，衍生化方法：取细胞或组织的代谢提取物，然后依次加入10
‑
50 mM N, N
‑
二甲基对苯二胺溶液、5
‑
30 mM 1
‑
（3
‑
二甲氨基丙基）
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和0.5
‑
10 mM 咪唑溶液，混匀后在30
‑
60℃水浴中反应10
‑
120min；步骤2，衍生化产物的纯化：向反应溶液中加入水和乙酸乙酯的混合溶液进行萃取，13000 rpm、4℃、离心5 min，吸取水层，氮吹至干，3%乙腈水溶液复溶，加入内标溶液；步骤3，将步骤2得到的溶液，利用超高效液相色谱
‑
串联质谱进样检测，通过标准曲线计算得到各代谢物含量；所述超高效液相色谱
‑
串联质谱的检测条件如下：色谱柱：CORTECS UPLC T3 Column，规格为2.1
ꢀ×ꢀ
150 mm、1.6 μm；柱温：45℃；进样量：2 μL；流速：0.2 mL/min；流动相组成：流动相A：10 mM甲酸铵的水溶液；流动相B：乙腈；采用梯度洗脱的方式，洗脱条件如下表：质谱条...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽芳，嵇晓圆，辛贵忠，郑佳逸，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：