一种银杏DPP-Ⅳ抑制肽的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种银杏DPP

【技术实现步骤摘要】
一种银杏DPP
‑Ⅳ
抑制肽的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种银杏DPP
‑Ⅳ
抑制肽的制备方法，属于食品与生物


技术介绍

[0002]我国银杏资源丰富，产量较大，银杏干制品中蛋白含量丰富，银杏蛋白氨基酸组成合理，为优质植物蛋白，球蛋白和清蛋白为银杏蛋白的主要组分。目前，银杏大多作为干果销售，价格低廉，深加工产品较少，银杏市场需求未能有效拓展，导致产量过剩，供大于求，直接制约了我国银杏产业的进一步持续健康发展。因此，迫切需要研发银杏深加工产品，提高银杏的附加值。
[0003]食源性生物活性肽被认为是新一代的生物活性调节剂，主要来源于动物蛋白和植物蛋白，具有抗氧化、抗疲劳、调节免疫、降血压、降血脂和降血糖等广泛的生理功能。糖尿病及其并发症是严重危害人类健康的慢性疾病，预计到2045年，全球糖尿病患者将达到约7亿。二肽基肽酶
‑
IV(dipeptidyl peptidase
‑
IV，DPP
‑
IV)是细胞表面的一种丝氨酸蛋白酶，抑制DPP
‑
IV活性有利于控制血糖水平。目前临床上使用的西格列汀、利格列汀和沙格列汀等降血糖药物的作用机制都是靶向抑制DPP
‑
IV活性，但这些药物往往伴随着一定副作用。食源性DPP
‑Ⅳ
抑制肽由于其无毒副作用、安全性高，且对血糖正常者无降血糖作用，极具开发利用潜力。
[0004]迄今为止，已鉴定的DPP
‑
>IV食品蛋白衍生肽抑制剂尚未显示出与合成药物抑制剂同等的效力，因此需要进一步筛选新型DPP
‑Ⅳ
抑制肽。银杏肽为银杏蛋白经过单酶或复酶水解后分离所得的低聚肽，已被证实具有抗氧化、降血脂、降血压、降血糖和肝保护等作用。评估了银杏球蛋白作为DPP
‑Ⅳ
抑制肽来源的潜力，分析结果表明银杏球蛋白中含有大量的DPP
‑Ⅳ
抑制肽片段，提示银杏球蛋白是DPP
‑Ⅳ
抑制肽的优质蛋白来源。目前，有关银杏蛋白源DPP
‑Ⅳ
抑制肽的制备未见报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是针对现有食源性DPP
‑Ⅳ
抑制肽未显示出与合成药物抑制剂同等效力的问题，提供一种新型的银杏球蛋白源的DPP
‑Ⅳ
抑制肽的制备方法，该方法制备的银杏肽具有较高的DPP
‑Ⅳ
抑制活性，且制备工艺高效、快速，过程易于控制。
[0006]本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
[0007]一种银杏DPP
‑Ⅳ
抑制肽的制备方法，包括如下步骤：
[0008](1)将银杏脱壳、去皮后烘干，然后粉碎，过60目筛，得到银杏粉，将银杏粉加入到石油醚中浸泡脱脂，结束后抽滤，干燥，得到脱脂银杏粉；
[0009](2)将脱脂银杏粉加入到氯化钠溶液中进行提取，结束后离心收集上清液，往上清液中分批加入硫酸铵至其饱和度达70％～80％，静置过夜后离心，将所得沉淀透析、浓缩、冷冻干燥，得到银杏球蛋白；
[0010](3)将银杏球蛋白加入到去离子水中，混合均匀后得到悬浮液，加入蛋白酶进行酶
解，结束后沸水浴灭酶，将得到的产物通过截留分子量为1000Da的超滤膜过滤，收集滤液并冷冻干燥，得到银杏DPP
‑Ⅳ
抑制肽；
[0011]步骤(3)中，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、菠萝蛋白酶或木瓜蛋白酶中的任意一种。
[0012]进一步，步骤(2)中，氯化钠溶液的质量浓度为8～12％，脱脂银杏粉和氯化钠溶液的质量体积比为1:15～1:20。
[0013]进一步，步骤(2)中，所述提取温度为55～60℃，提取时间为2～4h。
[0014]进一步，步骤(2)中，所述透析采用的是截留分子量为3500Da的透析膜，时间为48～72h。
[0015]进一步，步骤(3)中，银杏球蛋白和去离子水的质量体积比为1:15～1:20。
[0016]进一步，步骤(3)中，当蛋白酶为胃蛋白酶时，酶解条件为：酶与底物质量比1:50～1:100，酶解温度37℃，酶解pH3.0～3.5，酶解时间2.5～3.5h。
[0017]进一步，步骤(3)中，当蛋白酶为菠萝蛋白酶时，酶解条件为：酶与底物质量比1:50～1:100，酶解温度50～55℃，酶解pH6.5～7.0，酶解时间3～4h。
[0018]进一步，步骤(3)中，当蛋白酶为木瓜蛋白酶时，酶解条件为：酶与底物质量比1:50～1:100，酶解温度50～55℃，酶解pH7.5～8.0，酶解时间3～4h。
[0019]本专利技术的有益效果：
[0020]本专利技术公开了一种银杏DPP
‑Ⅳ
抑制肽的制备方法，该方法高效、快速，过程易于控制，制备的银杏肽DPP
‑Ⅳ
抑制活性高(IC
50
值≤0.3mg/mL)、无毒副作用，相对分子质量较小(150～1000Da)，易被人体吸收。
具体实施方式
[0021]下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案作清楚、详细的描述。
[0022]下述实施例中，涉及的检测方法有：
[0023]①
DPP
‑Ⅳ
抑制活性：
[0024]采用荧光法，以Gly
‑
Pro
‑
AMC为底物，测定银杏肽DPP
‑Ⅳ
抑制活性。依次将50μL20mmol/L Tris
‑
HCl缓冲液(pH8.0)、10μL DPP
‑
IV、10μL抑制剂加入到酶标板，混匀，37℃孵育5min，加入30μL 10mmol/L荧光底物Gly
‑
Pro
‑
MCA溶液启动反应，37℃继续孵育30min，利用酶标仪测定其荧光强度，激发波长380nm，发射波长450nm。
[0025]DPP
‑
IV抑制率(％)＝(F1－F2)/F1×
100。
[0026]式中：F1和F2分别为对照组和实验组的荧光强度。
[0027]IC
50
值为DPP
‑Ⅳ
抑制率为50％时的银杏肽质量浓度。将银杏肽稀释成7个浓度梯度，测定各浓度梯度的DPP
‑Ⅳ
抑制率，计算出银杏肽对DPP
‑Ⅳ
抑制活性的IC
50
值。
[0028]②
相对分子质量测定：采用高效液相色谱仪测定银杏肽的相对分子质量分布。色谱条件：色谱柱TSK
‑
GEL G2000 SW，7.5
×
300mm；流动相乙腈/水/三氟乙酸(10/90/0.1，v/v)；检测波长220nm；流速0.5mL/min；进样量20μL。
[0029]实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种银杏DPP
‑Ⅳ
抑制肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将银杏脱壳、去皮后烘干，然后粉碎，过60目筛，得到银杏粉，将银杏粉加入到石油醚中浸泡脱脂，结束后抽滤，干燥，得到脱脂银杏粉；(2)将脱脂银杏粉加入到氯化钠溶液中进行提取，结束后离心收集上清液，往上清液中分批加入硫酸铵至其饱和度达70％～80％，静置过夜后离心，将所得沉淀透析、浓缩、冷冻干燥，得到银杏球蛋白；(3)将银杏球蛋白加入到去离子水中，混合均匀后得到悬浮液，加入蛋白酶进行酶解，结束后沸水浴灭酶，将得到的产物通过截留分子量为1000Da的超滤膜过滤，收集滤液并冷冻干燥，得到银杏DPP
‑Ⅳ
抑制肽；步骤(3)中，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、菠萝蛋白酶或木瓜蛋白酶中的任意一种。2.如权利要求1所述银杏DPP
‑Ⅳ
抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，氯化钠溶液的质量浓度为8～12％，脱脂银杏粉和氯化钠溶液的质量体积比为1:15～1:20。3.如权利要求1所述银杏DPP
‑Ⅳ
抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述提取温度为55～60℃，提取时间为2～4h。4.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑义，李闯，李诗颖，梁一凡，周小芮，
申请(专利权)人：徐州工程学院，
类型：发明
国别省市：