使用自动化DESI-MS的高通量无标记酶促生物测定制造技术

本发明专利技术总体上涉及使用解吸电喷雾电离

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用自动化DESI
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MS的高通量无标记酶促生物测定
[0001]相关申请
[0002]本申请要求于2020年5月11日提交的美国临时专利申请序列号63/022,715的权益和优先权，该美国临时专利申请的内容通过引用整体并入本文。
[0003]政府利益
[0004]本专利技术是根据代表国防高级研究计划局(Defense Advanced Projects Research Agency)的陆军研究办公室(Army Research Office)授予的W911NF
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0020在政府支持下进行的。政府享有本专利技术中的某些权利。


[0005]本专利技术总体上涉及使用解吸电喷雾电离
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质谱法(DESI
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MS)的高通量无标记酶促生物测定。

技术介绍

[0006]酶是重要的药物靶标。现今许多市售药物通过抑制介导疾病表型的酶发挥作用。酶抑制剂是一类重要的药理药剂。通常这些分子是底物结合的竞争性可逆抑制剂。
[0007]为此，酶测定是用于测量细胞活性以及用于监测酶蛋白的重要工具。酶动力学的测量提供了关于酶催化的机制以及酶与底物、抑制剂、药物和药物候选物之间的相互作用的关键信息。

技术实现思路

[0008]本专利技术提供了一个高通量平台，该平台组合了一组相互关联的方法，其中可以使用质谱法产生发生反应的液滴和薄膜(在某些实施例中任选地加速反应)，同时或随后使用质谱法分析液滴和/或薄膜中的产物分布。此平台对许多不同的化学和生物系统具有广泛的适用性。在本文所描述的实施例中，此平台应用于酶促反应和酶促测定。
[0009]在某些方面，本专利技术提供了用于监测酶促反应的方法。这些方法涉及在底物上制备多个离散斑点。在某些实施例中，该多个离散斑点中的每一个来自酶促反应中的不同时间点。在其它实施例中，对于具有不同抑制剂/再激活剂/底物/酶浓度的不同反应，这些离散斑点中的每一个可以来自同一时间点。例如，基于同一终点的设置对于药物发现更为常见，而基于不同时间点的设置对于生化研究和酶表征更为常见。
[0010]这些离散斑点中的每一个可以包括酶促反应的底物和产物。然后，这些方法涉及以下：将来自电离源的排出物依次引导到该多个离散斑点中的每一个上，以从这些离散斑点中的每一个中依次解吸该底物和/或该产物并由这些离散斑点中的每一个依次产生该底物和/或该产物的进入质谱仪的离子；以及依次分析该质谱仪中来自这些离散斑点中的每一个的该底物和/或该产物的该离子，由此监测该酶促反应。如上所述，在某些实施例中，该多个离散斑点中的每一个可以来自在制备步骤之前已经停止的酶促反应中的不同时间点。在其它实施例中，该多个离散斑点中的每一个来自在制备步骤之前尚未停止的酶促反应中
的不同时间点。在某些实施例中，将化合物添加到反应混合物中以充当定量的内标物。
[0011]在其它方面，本专利技术提供了用于监测酶促反应的方法，该酶促反应涉及在底物上制备多个离散斑点。在某些实施例中，将化合物添加到反应混合物中以充当定量的内标物。这些离散斑点中的每一个可以包括酶促反应的底物和产物。此类方法另外地涉及以下：将来自电离源的排出物依次引导到该多个离散斑点中的每一个上，以从这些离散斑点中的每一个中依次解吸该底物和/或该产物并由这些离散斑点中的每一个依次产生该底物和/或该产物的进入质谱仪的离子；依次获得该质谱仪中来自这些离散斑点中的每一个的该底物和/或该产物的这些离子的离子强度；以及通过应用校准曲线将来自这些离散斑点中的每一个的该底物和/或该产物的这些离子的离子强度转换为该底物与该产物的浓度比，由此监测该酶促反应。在某些实施例中，该多个离散斑点中的每一个来自在制备步骤之前已经停止的酶促反应中的不同时间点。在其它实施例中，该多个离散斑点中的每一个来自在制备步骤之前尚未停止的酶促反应中的不同时间点。在某些实施例中，这些方法测量的不一定是产物与底物的比率，而是产物和底物中的任一者与内标物的比率。
[0012]在上述方法的某些实施例中，该电离源为解吸电喷雾电离(DESI)探针并且该排出物为DESI喷雾。
[0013]在上述方法的某些实施例中，该多个离散斑点中的每一个的子集进一步包括相同的测试化合物。在此类实施例中，该方法进一步包括基于对该酶促反应的进展的监测来确定该测试化合物是否抑制该酶促反应。在此类实施例中，该方法进一步包括基于对该酶促反应的进展的监测来确定该测试化合物抑制该酶促反应的完全程度。在此类实施例中，该酶促反应与生理病状相关，并且确定该测试化合物抑制该酶促反应的完全程度确定了是否应考虑将该测试化合物开发成治疗该病状的药物。
[0014]在其它实施例中，该多个离散斑点中的每一个的子集进一步包括该酶促反应的酶的抑制剂和测试化合物。在此类实施例中，该方法进一步包括确定该测试化合物是否可以抵消该抑制剂以及重新开始该酶促反应。在此类实施例中，该方法进一步包括基于对该酶促反应的进展的监测来确定该测试化合物抵消该抑制剂的完全程度以及重新开始该酶促反应的完全程度。在此类实施例中，确定该测试化合物抵消该抑制剂的完全程度以及重新开始该酶促反应的完全程度确定了是否应考虑将该测试化合物开发成抵消该抑制剂的药物。
附图说明
[0015]图1描述了高通量平台的概述。
[0016]图2描述了高通量平台的另一实施例。
[0017]图3A
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D描述了使用高通量平台的实施例的示例性工作流程。
[0018]图4是示出了使用本文所描述的平台针对对直接来自含有表面活性剂和非挥发性缓冲液两者的生物测定混合物的酶促反应的监测所获得的光谱的代表性实例的图。
[0019]图5示出了根据DESI
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MS数据(使用离子强度(m/z 104)/(m/z 146+m/z 104)计算的反应的经验进展可以使用测得的离子比与混合物中胆碱与乙酰胆碱的实际浓度比之间的简单校准曲线直接转换为实际反应进展([胆碱]/([乙酰胆碱]+[胆碱])。
[0020]图6示出了酶促反应随时间的进展可以通过每1
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5分钟猝灭生物测定混合物的等
分试样并测量胆碱离子比(使用离子强度(m/z 104)/(m/z 146+m/z 104))很容易地获得。
[0021]图7示出了乙酰胆碱酯酶(AChE)的米
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曼氏图(Michaelis Menten plot)是使用18个独立的反应进展曲线(独立的一式三份的六种底物浓度：0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、1.0mM)构建的。
[0022]图8示出了在使用分别为9μg/mL和5mM的较高浓度的酶和底物的情况下，反应可以在五分钟内完成并且在<15分钟内分析384种抑制反应，同时实现了优异的灵敏度。
[0023]图9示出了使用不同的DESI源和不同的质谱仪(Waters源和Synapt G2 qT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于分析一种或多种酶促反应的方法，所述方法包括：在底物上制备多个离散斑点，其中所述离散斑点中的每一个包括一种或多种酶促反应的底物和产物；将来自电离源的排出物依次引导到所述多个离散斑点中的每一个上，以从所述离散斑点中的每一个中依次解吸所述底物和/或所述产物并由所述离散斑点中的每一个依次产生所述底物和/或所述产物的进入质谱仪的离子；以及依次分析所述质谱仪中来自所述离散斑点中的每一个的所述底物和/或所述产物的所述离子，由此分析所述一种或多种酶促反应。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述电离源为解吸电喷雾电离探针(DESI)并且所述排出物为DESI喷雾。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个离散斑点中的每一个的子集进一步包括相同的测试化合物。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括基于对所述酶促反应的进展的监测来确定所述测试化合物是否抑制所述酶促反应。5.根据权利要求4所述的方法，其进一步包括基于所述对所述酶促反应的进展的监测来确定所述测试化合物抑制所述酶促反应的完全程度。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述酶促反应与生理病状相关，并且确定所述测试化合物抑制所述酶促反应的完全程度确定了是否应考虑将所述测试化合物开发成治疗所述病状的药物。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个离散斑点中的每一个的子集进一步包括所述酶促反应的酶的抑制剂和测试化合物。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述方法进一步包括确定所述测试化合物是否能够抵消所述抑制剂以及重新开始所述酶促反应。9.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括基于所述对所述酶促反应的进展的监测来确定所述测试化合物抵消所述抑制剂的完全程度以及重新开始所述酶促反应的完全程度。10.根据权利要求9所述的方法，其中确定所述测试化合物抵消所述抑制剂的完全程度以及重新开始所述酶促反应的完全程度确定了是否应考虑将所述测试化合物开发成抵消所述抑制剂的药物。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个离散斑点中的每一个来自酶促反应中的不同时间点。12.一种用于分析一种或多种酶促反应的方法，所述方法包括：在底物上制备多个离散斑点，其中所述离散...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗伯特，
申请(专利权)人：普度研究基金会，
类型：发明
国别省市：