一种检测豆芽中甲硝唑残留量的方法及免疫层析试纸技术

本发明专利技术公开了一种检测豆芽中甲硝唑残留量的方法及免疫层析试纸，包括以下步骤，检测样本预备和标记抗体溶液准备；对抗体偶联pH值优化；标记纳米材料粒径筛选；检测线包被浓度确定，将标记抗体的复合物喷于结合垫上，与NC膜、吸水纸、样品垫按一种顺序组成试纸条；在最优条件下检测豆芽中甲硝唑残留量完成样本检测。本发明专利技术的有益效果：通过对抗体偶联pH值优化，标记颗粒粒径筛选，包被浓度的确定，在最优条件下制备了上转换发光免疫层析试纸，本发明专利技术方法检测限可达1.01ng

【技术实现步骤摘要】
一种检测豆芽中甲硝唑残留量的方法及免疫层析试纸


[0001]本专利技术涉及食品检测的
，尤其涉及一种基于上转换荧光纳米材料免疫层析法快速检测甲硝唑的方法以及免疫层析试纸。

技术介绍

[0002]甲硝唑(Metronidazole，MNZ)，又名灭滴灵，属于硝基咪唑类抗生素，能快速杀灭厌氧细菌和抑制感染，在1978年被世界卫生组织定为抗厌氧菌首选药。豆芽在种植、运输和保存过程中，由于保存方法不当，容易导致厌氧细菌繁殖，影响豆芽保质期和品相，因此某些不良商家通过添加甲硝唑等抗生素提高豆芽产量和延长保质期。但硝基咪唑类药物对哺乳动物具有致癌、致畸、致突变作用和遗传毒性，通过食品接触可能对人类健康构成潜在威胁。
[0003]根据国家标准GB 31650
‑
2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》中规定动源性食品中不得检出甲硝唑。所以甲硝唑残留量检测方法至关重要。目前，精准检测甲硝唑残留的方法主要有高效液相色谱法、液相色谱－质谱联用法，而现场快速检测技术主要有胶体金免疫层析。前两种方法灵敏度高、重复性好、检出限低，但样品前处理麻烦、仪器设备昂贵，对操作人员的要求高，不适用于现场快速检测，后者虽能现场快速检测，但该方法多用人眼目测条带显色的有无或深浅进行结果判读，存在人为主观判断误差，且无法定量检测。

技术实现思路

[0004]本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。
[0005]鉴于上述现有存在的问题，提出了本专利技术。
[0006]因此，本专利技术解决的技术问题是：提供可快速定量检测豆芽中甲硝唑残留量的方法及基于该方法的试纸。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：一种快速定量检测豆芽中甲硝唑残留量的方法，包括以下步骤，检测样本预备和标记抗体溶液准备；对抗体偶联pH值优化；标记纳米材料粒径筛选；检测线包被浓度确定，将标记抗体的复合物喷于结合垫上，与NC膜、吸水纸、样品垫按一种顺序组成试纸条；在最优条件下检测豆芽中甲硝唑残留量完成样本检测。
[0008]优选的，所述对抗体偶联pH值优化包括以下准备步骤，取3个1.5ml离心管，编号1、2和3，每管加0.5mg纳米材料溶液，超声清洗、离心去除上清液，加入1ml MES溶液超声重悬；重复一次上述步骤，配制NHS和EDC溶液，加入适量体积于所述重悬溶液中，进行羧基活化，放于DNA旋转混合仪，旋转15min，离心去除上清液，加入适量纯水，超声重悬；再同样步骤离心一次，使溶液中的NHS和EDC尽量除去，在离心管1、2、3中分别加入pH值为5、7、9的缓冲溶
液，超声重悬；在3个离心管中分别加入适量的甲硝唑抗体，偶联2～4h或4℃过夜；加入适量的封闭剂封闭未结合蛋白的羧基位点，30min后离心，加入颗粒保存液，超声重悬，重复此步骤2次，最后得到标记抗体溶液，4℃保存待用。
[0009]优选的，所述标记纳米材料粒径筛选包括以下准备步骤，取粒径分别为30nm、60nm和100nm的3种纳米材料，加入编号1、2、3的1.5mL离心管，超声清洗、离心去除上清液，加入1ml MES溶液超声重；重复一次上述步骤，将适量NHS和EDC加入于纳米溶液中，进行羧基的活化，然后放于DNA旋转混合仪中，15min后离心去除上清液，加入适量纯水，超声重悬；再同样步骤离心一次，使溶液中的NHS和EDC尽量除去，加入适量缓冲溶液，超声重悬，在离心管1、2、3中分别加入适量的甲硝唑抗体，偶联2～4h或4℃过夜；加入适量的封闭剂封闭未结合蛋白的羧基和非特异性位点，30min后离心，加入颗粒保存液，超声重悬，重复此步骤2次，最后得到标记抗体溶液，4℃保存待用。
[0010]优选的，所述检测线包被浓度确定包括以下准备步骤，检测线用适合的缓冲液将MNZ
‑
BSA终浓度配制成0.5、1.0、1.5和2.0mg
·
mL
‑1，质控线用适合的缓冲液将羊抗兔IgG配制成终浓度为1.0mg
·
mL
‑1；不同终浓度的检测线和质控线包被到NC膜上，37℃烘箱过夜；将标记抗体的复合物喷于结合垫上，与NC膜、吸水纸、样品垫按一种顺序组成试纸条；用合适的样本稀释液接触层析试纸，借助仪器，观察信号，以阴性样本和阳性样本最大区别为最优条件。
[0011]优选的，所述检测样本预备包括，取20g具有代表性的豆芽进行捣碎或搅碎，称取5g样本于50mL离心管中，加入5mL甲硝唑提取液，充分摇匀震荡，3000rpm离心5min，上清液即为待测液，备用。
[0012]优选的，所述样本检测包括，将组装好的免疫层析试纸放于实验台上，取100uL待测液与100uL样本稀释液充分摇匀震荡，低速离心机离心30s，取100uL滴加于试纸加样孔上，10min后检测仪读值，测定其甲硝唑含量。
[0013]优选的，所述对抗体偶联pH值优化，选择pH值为7作为最优条件。
[0014]优选的，所述标记纳米材料粒径筛选，当纳米材料粒径增大时，阴性样本和阳性样本之间的差也随着变大，选择纳米材料粒径在100nm时为最优。
[0015]优选的，所述检测线包被浓度确定，当包被浓度为1.0mg
·
mL
‑1时，阴性样本和阳性样本之间的差最大，故选择该包被浓度为检测的最优条件。
[0016]一种基于上转换发光材料的甲硝唑免疫层析试纸，包括如上述的快速定量检测豆芽中甲硝唑残留量的方法，所述甲硝唑免疫层析试纸检测限可达1.01ng
·
mL
‑1，加标回收率为90.6％～99.7％，变异系数为3.5％～19.4％，检测时间为10min。
[0017]本专利技术的有益效果：通过对抗体偶联pH值优化，标记颗粒粒径筛选，包被浓度的确定，在最优条件下制备了上转换发光免疫层析试纸，本专利技术方法检测限可达1.01ng
·
mL
‑1，加标回收率为90.6％～99.7％，变异系数为3.5％～19.4％，检测时间为10min。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它
的附图。其中：
[0019]图1为本专利技术所述免疫层析检测原理示意图；
[0020]图2为本专利技术抗体偶联pH值优化层析曲线的示意图；
[0021]图3为本专利技术标记纳米材料粒径优化层析曲线及不同纳米材料粒径扫描电镜图的示意图；
[0022]图4为本专利技术不同检测线包被蛋白浓度优化层析曲线的示意图。
具体实施方式
[0023本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速定量检测豆芽中甲硝唑残留量的方法，其特征在于：包括以下步骤，检测样本预备和标记抗体溶液准备；对抗体偶联pH值优化；标记纳米材料粒径筛选；检测线包被浓度确定，将标记抗体的复合物喷于结合垫上，与NC膜、吸水纸、样品垫按一种顺序组成试纸条；在最优条件下检测豆芽中甲硝唑残留量完成样本检测。2.如权利要求1所述的快速定量检测豆芽中甲硝唑残留量的方法，其特征在于：所述对抗体偶联pH值优化包括以下准备步骤，取3个1.5ml离心管，编号1、2和3，每管加0.5mg纳米材料溶液，超声清洗、离心去除上清液，加入1ml MES溶液超声重悬；重复一次上述步骤，配制NHS和EDC溶液，加入适量体积于所述重悬溶液中，进行羧基活化，放于DNA旋转混合仪，旋转15min，离心去除上清液，加入适量纯水，超声重悬；再同样步骤离心一次，使溶液中的NHS和EDC尽量除去，在离心管1、2、3中分别加入pH值为5、7、9的缓冲溶液，超声重悬；在3个离心管中分别加入适量的甲硝唑抗体，偶联2～4h或4℃过夜；加入适量的封闭剂封闭未结合蛋白的羧基位点，30min后离心，加入颗粒保存液，超声重悬，重复此步骤2次，最后得到标记抗体溶液，4℃保存待用。3.如权利要求1所述的快速定量检测豆芽中甲硝唑残留量的方法，其特征在于：所述标记纳米材料粒径筛选包括以下准备步骤，取粒径分别为30nm、60nm和100nm的3种纳米材料，加入编号1、2、3的1.5mL离心管，超声清洗、离心去除上清液，加入1ml MES溶液超声重；重复一次上述步骤，将适量NHS和EDC加入于纳米溶液中，进行羧基的活化，然后放于DNA旋转混合仪中，15min后离心去除上清液，加入适量纯水，超声重悬；再同样步骤离心一次，使溶液中的NHS和EDC尽量除去，加入适量缓冲溶液，超声重悬；在离心管1、2、3中分别加入适量的甲硝唑抗体，偶联2～4h或4℃过夜；加入适量的封闭剂封闭未结合蛋白的羧基和非特异性位点，30min后离心，加入颗粒保存液，超声重悬，重复此步骤2次，最后得到标记抗体溶液，4℃保存待用。4.如权利要求1所述的快速定量检测豆芽中甲硝唑残留量的方法，其特征在于：所述检测线包被浓度确定包括以下准备步骤，检测线用适合的缓冲液将MNZ
...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦何雯，朱凡君，费建枫，郭跃平，
申请(专利权)人：杭州纽太生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：