【技术实现步骤摘要】
利用MSC
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miRNA
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198
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exo治疗NSCLC相关恶性胸腔积液的方法
[0001]本专利技术涉及外泌体
,具体为利用MSC
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miRNA
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198
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exo治疗NSCLC相关恶性胸腔积液的方法。
技术介绍
[0002]外泌体含有多种生物活性物质(核酸、蛋白质、脂质),是细胞间信息传递的媒介,参与肿瘤细胞增殖、转移、侵袭和血管生成等过程。间充质干细胞(MSC)是一种多能成体干细胞,可由骨髓、脐带、脂肪、滑膜及外周血等组织中分离。以干细胞为基础的治疗方法可参与肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)形成,并与肿瘤细胞相互作用促进肿瘤生长,MSCs能通过旁分泌发挥其治疗效能,外泌体正是MSCs旁分泌的主要物质。外泌体为一类直径在40~160nm之间的胞外囊泡,可在100000g下离心收集,在
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80℃的环境中储存3
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5年。相比于MSCs的全细胞疗法,MSC
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EXO有良好的耐受性,并且免疫原性的不良反应风险更低,且便于获取及操作。外泌体对肿瘤进展的影响已受到广泛关注,MSC
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EXO可通过支持或抑制两种方式影响肿瘤的发展。MSC
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EXO促进乳腺癌细胞的增殖及转移,进一步探索发现MSC
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EXO含多种促进肿瘤的miRNAs,如miR
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21和miR
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.利用MSC
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miRNA
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198
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exo治疗NSCLC相关恶性胸腔积液的方法,包括以下步骤:步骤一,转染MSC;步骤二,提取MSC
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miRNA
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198
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exo;步骤三,构建裸鼠MPE模型;步骤四,干预恶性胸腔积液小鼠;步骤五,评估疗效;其特征在于:其中在上述步骤一中,取1EP管加1200μl OPTI
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MEM,加入9μg pCL
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Ampho和15μg pMXS
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hsa
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miR
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198
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GFPuro#7质粒,再加入84μl Lipofectamine
TM
2000转染试剂,混匀静置15min;200μl质粒
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转染试剂混合物加至293T细胞的培养板中,温育2h;加4ml 293T完全培养液,培养过夜;24h后更换为新鲜培养液;48h、72h、96h收集病毒上清,收集的病毒液在35℃,3000
×
g离心10min,再经0.45μm过滤器过滤;过滤的病毒液加入polybrene(工作浓度为2.5ng/μl),混匀;5ml病毒液加入接种MSC的6孔板中,构建过表达miR
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198的MSC细胞;转然后荧光显微镜及qT
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PCR验证转染效率;其中在上述步骤二中,对上述步骤一中所获取的MSC
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miR
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198细胞进行培养,在3代至10代的细胞培融合度达85%左右时,收集细胞培养上清,使用超速离心法提取外泌体;通过电子透射显微镜及粒径分析验证提取的外泌体,通过BCA蛋白浓度测定外泌体浓度;其中在上述步骤三中,取BALB/c裸鼠,腹腔内注射麻醉,碘伏消毒心前区皮肤,剑突右侧上方约1cm处做一个长约0.5cm的纵行切口,找到肋骨及肋间隙,避开血管用1ml胰岛素注射器在肋间隙注入以100ul PBS重悬的6
×
106对数期的A549细胞,注射完毕后缝合伤口,对皮消毒,青霉素粉末涂抹伤口;裸鼠在A549细胞造模后的第14天及第28天进行PET
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CT扫描;其中在上述步骤四中,在A549细胞造模后的第5天、7天、9天时胸腔内注射PBS重悬的MSC
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miR
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198
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exo;其中在上述步骤五中,观察并检测上述步骤四中的实验小鼠,观察得出:给予MSC
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miRNA
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198
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Exos的小鼠胸膜组织的血管数量减少,胸膜血管渗透性降低,小鼠胸腔内肿瘤的生长和恶性胸腔积液的形成受到明显抑制;ELISA检测结果为:MSC
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miRNA
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