检测TLR10rs28393318基因型的方法及其在评估长期移植肾功能中的应用技术

本发明专利技术提供了一种检测TLR10rs28393318基因型的方法及其在评估肾移植受试者长期移植肾功能中的应用。TLR10rs28393318的基因型可用于预测肾移植患者长期移植肾功能，从而可用于指导临床治疗以提高移植肾的长期存活率，所以本发明专利技术提供的检测TLR10rs28393318基因型的方法可以提高对肾移植受试者长期移植肾功能的预测敏感度，为制备相应的预测或评估产品提供策略，具有很大的社会效益及经济效益。具有很大的社会效益及经济效益。具有很大的社会效益及经济效益。

【技术实现步骤摘要】
检测TLR10 rs28393318基因型的方法及其在评估长期移植肾功能中的应用


[0001]本专利技术涉及基因检测
，具体涉及一种检测TLR10 rs28393318基因型的方法及其在评估长期移植肾功能中的应用。

技术介绍

[0002]肾脏移植作为最早开展的器官移植术之一，是终末期肾脏病的一种非常有效的治疗方法。随着移植器官获取保存的规范化、移植手术的日臻成熟和新型免疫抑制剂的广泛应用，移植肾的存活率日渐提高，存活时间也不断延长，移植患者的身体健康与生活质量都得到了极大的改善，肾脏移植成为了除腹膜透析和血液透析外终末期肾脏病患者的最佳选择。但移植肾脏的长期存活仍是肾脏移植面临的一个重大问题，而移植后肾功能的持续下降与移植肾的存活密切相关。肾小球滤过率(Estimate glomerular filtration rate，eGFR)是评价肾功能的最好的指标，eGFR随时间的变化是评估移植后肾功能进程的推荐手段。肾移植患者需要长期使用免疫抑制剂来降低移植排斥，以提高移植肾的存活率。而免疫抑制剂作用不足可能增加排斥反应的风险，过强有可能引起不良反应的发生，包括肾毒性等，这些因素都会影响移植后eGFR的变化，使得移植后肾功能在个体间具有很大的差异。
[0003]遗传因素是造成移植肾功能的个体差异的重要因素之一，而单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNP)是最常见的遗传变异形式，90％的个体差异是由SNP造成的。
[0004]Toll样受体(Toll/>‑
like receptors，TLRs)是参与天然免疫的一类重要蛋白质分子，是微生物入侵后预警免疫系统必需的天然免疫受体，在机体抗感染免疫激活机体天然免疫中发挥重要作用。并且TLRs通过调控单核/巨噬细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞的活化，CD80等第二信号的表达，在天然免疫和获得性免疫之间起着重要的桥梁作用。此外，新近的研究表明，TLRs还参与某些自身免疫性疾病及机体的移植免疫，动物实验和临床研究也报道了TLRs与同种异体排斥反应程度相关联，其过度的免疫应答反应可以引发移植物排斥反应。因此TLRs信号通路参与移植免疫的研究已成为器官移植领域研究的热点之一。
[0005]目前，在哺乳动物及人类中已经发现的人TLRs家族成员有13种，即TLR1
‑
TLR13。其分布十分广泛，主要分布于单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、多形核细胞、B细胞、T细胞、嗜碱性粒细胞及NK细胞等淋巴细胞。TLR10是TLRs家族的一个重要成员，主要表达在免疫相关的组织和细胞，包括脾、淋巴结、人类B细胞等。不同于其他TLRs家族成员，TLR10具有抑炎作用，对其他TLR信号、炎症因子的产生、单核细胞和B细胞的活化具有抑制作用。
[0006]已有文献研究报道了TLR10可能与一些肿瘤、免疫疾病和感染疾病相关，如膀胱癌、IgA肾病、克罗恩病、哮喘、肺曲霉菌病，关节炎等等。也有在同种异体造血干细胞移植患者中的研究中发现TLR10与急性移植物抗宿主疾病的发病相关。TLR10基因多态性与许多免疫性疾病的发病密切相关，而且TLRs与器官移植免疫的相关性已经得到公认，TLR10基因多态性对于评估肾移植患者长期移植肾功能具有重要意义。
[0007]目前仍无预测肾移植患者长期移植肾功能的可靠手段。鉴于它对移植肾长期存活率的影响，对其预测无疑具有很大的临床及经济学价值。

技术实现思路

[0008]为了克服现有技术中的缺陷，本专利技术提供了一种检测TLR10 rs28393318基因型的方法，进而为制备用于评估肾移植受试者长期移植肾功能以及评价受试者是否需要重点监测肾脏病理变化的产品提供策略。该检测TLR10 rs28393318基因型的方法采用时间飞行质谱(MALDI
‑
TOF)方法，其技术原理为首先通过PCR扩增含有SNP的基因组片段，然后通过序列特异性引物实现单碱基延伸，随后样品分析物与芯片基质共结晶后在真空管中受瞬时纳秒(10
‑9s)强激光激发。核酸分子因此解吸附成为单电荷离子，由于电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而检测出SNP位点信息。
[0009]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0010]本专利技术的第一方面是提供一种检测TLR10 rs28393318基因型的方法，其包括如下步骤：
[0011]步骤一，提取受试者全血基因组DNA，调整浓度后进行PCR扩增；
[0012]步骤二，扩增的PCR产物经SAP处理后，进行单碱基延伸反应；
[0013]步骤三，纯化单碱基延伸反应产物，用飞行时间质谱仪进行检测，进行基因分型。
[0014]进一步地，基因组DNA的浓度被调整为20
‑
50ng/μl。
[0015]进一步地，步骤一中PCR扩增所采用的引物的序列为SEQ ID No.：1和SEQ ID No.：2。
[0016]进一步地，步骤二中单碱基延伸反应所采用的单碱基延伸引物的序列为SEQ ID No.：3。
[0017]本专利技术的第二方面是提供上述方法采用的试剂在制备用于评估肾移植受试者长期移植肾功能的产品中的应用，该产品包括上述方法采用的试剂以及使用说明书。
[0018]进一步地，上述使用说明书包括如下指示：
[0019]a.采用上述方法检测TLR10 rs28393318基因型；
[0020]b.基于分型检测结果根据评估标准对受试者肾功能进行评估；该分型检测结果选自AA型、AG型和GG型中的一种；评估标准为：携带AA/AG型的受试者肾移植后肾功能的下降较携带GG型的受试者更快，肾功能损伤的风险更大。
[0021]进一步地，上述产品为试剂盒。
[0022]本专利技术的第三方面是提供上述方法采用的试剂在制备用于评价受试者是否需要重点监测肾脏病理变化的产品中的应用，该产品包括上述方法采用的试剂以及使用说明书。
[0023]进一步地，上述使用说明书包括如下指示：
[0024]a.采用上述方法检测TLR10 rs28393318基因型；
[0025]b.基于分型检测结果根据评价标准对受试者是否需要重点监测肾脏病理变化进行评价；该分型检测结果选自AA型、AG型和GG型中的一种；评价标准为：携带AA/AG型的受试者需要重点监测肾脏病理变化，调整治疗方案；携带GG型的受试者不需要重点监测肾脏病
inhibitor，CNI)、霉酚酸(Mycophenolic acid，MPA)和糖皮质激素。钙调磷酸酶抑制剂为他克莫司(TAC，普乐可复，Astellas，Ireland)，霉酚酸包括霉酚酸酯(MMF，骁悉，Roche，Shanghai，China)和霉酚酸钠(MPS，米芙，Novartis，Basel，Switzerland)，糖皮质激素为强的松或甲强龙。
[0044]T本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测TLR10 rs28393318基因型的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，提取受试者全血基因组DNA，调整浓度后进行PCR扩增；步骤二，扩增的PCR产物经SAP处理后，进行单碱基延伸反应；步骤三，纯化单碱基延伸反应产物，用飞行时间质谱仪进行检测，进行基因分型。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因组DNA的浓度被调整为20
‑
50ng/μl。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中PCR扩增所采用的引物的序列为SEQ ID No.：1和SEQ D No.：2。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中单碱基延伸反应所采用的单碱基延伸引物的序列为SEQ ID No.：3。5.如权利要求1
‑
4任一项所述方法采用的试剂在制备用于评估肾移植受试者长期移植肾功能的产品中的应用，其特征在于，包括所述方法采用的试剂以及使用说明书。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述使用说明书包括如下指示：a.采用所述方法检测TLR10 rs28393318基因型；b.基于分型检测结果根据评估标准对受试者肾功能进行评估；...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐勤霞，邱晓燕，张明，钟明康，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：