一种下垂辣椒离体再生体系的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种下垂辣椒离体再生体系的构建方法，属于植物组织培养技术领域。所示构建方法包括无菌苗的获取、诱导培养、继代培养、生根培养和炼苗移栽。本发明专利技术建立了经过无菌苗带柄子叶诱导获得下垂辣椒的高效再生体系，提高下垂辣椒再生率。本发明专利技术基于器官发生途径，以下垂辣椒带柄子叶为外植体，添加植物激素6

【技术实现步骤摘要】
一种下垂辣椒离体再生体系的构建方法


[0001]本专利技术属于植物组织培养
，具体涉及一种下垂辣椒离体再生体系的构建方法。

技术介绍

[0002]辣椒（Capsicumspp.）为茄科辣椒属一年生或多年生植物，起源于中南美洲地区，是世界上最早驯化的蔬菜作物之一。由于辣椒兼具蔬菜和调味品的功能，世界范围内具有极高的经济价值。辣椒具有食用、观赏以及医药等功能，有极高的经济与研究价值。目前辣椒属中已鉴定出35个种，其中包括5个辣椒栽培种，分别为：一年生辣椒（C. aunuum L.）、中国辣椒（C. chinense Jacq.）、灌木状辣椒（C. frutescens L.）、下垂辣椒（C. baccatum L.）和柔毛辣椒（C. pubesens Ruiz＆Pavon）。下垂辣椒产地在南美洲，花单生，且花冠具有黄色或绿色斑点，与其他辣椒栽培种之间存在明显的形态学差异与遗传差异，并存在生殖隔离。
[0003]离体再生研究是植物生物技术和植物生物学基础研究的关键，以植物部分器官为外植体的离体再生途径有两种：体细胞胚发生途径和器官发生途径。体细胞胚发生途径经历胚性愈伤组织、早期原胚、球形胚、心形胚和鱼雷胚等阶段形成成熟子叶胚，最终生长成完整植株；器官发生途径在外植体产生愈伤组织时直接出现不定芽的芽原基，接着发育成不定芽、诱导不定根，最终生长出完整植株。一般器官发生途径形成完整植株的时间短于体细胞胚发生途径。
[0004]相对于茄科其他物种，辣椒离体再生体系构建发展较慢，严重的限制了辣椒功能基因研究和发展。辣椒再生体系主要集中在一年生辣椒（C. annuum）和中国辣椒（C. chinense）中的部分品种与品系。辣椒是组织培养顽拗性植物，同一个栽培种中的不同基因型（不同种质、品种）都存在显著差异，不同栽培种之间参考性较弱，需要付出大量精力探索外植体类型、激素种类及浓度、再生途径等，从而获得各栽培种品种或种质理想的离体再生体系。有报道以下垂辣椒一个品种的叶片为外植体，添加2，4
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D和Kn，通过体细胞胚发生途径，离体再生出完整植株，本团队利用同样外植体和激素配方，实验了多个下垂辣椒品种或种质，未离体再生出完整植株，提示下垂辣椒离体再生还需继续探索。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对目前下垂辣椒离体再生体系的不足，提供一种稳定、高效、诱导率高的下垂辣椒离体再生体系的构建方法。
[0006]本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：一种下垂辣椒离体再生体系的构建方法，它包括以下步骤：S1. 无菌苗的获取：取下垂辣椒种子，用超纯水浸泡后灭菌处理，用无菌滤纸吸干后接种到MS固体培养基上获得无菌苗；S2.诱导培养：将生长15～25d的无菌苗切取带柄子叶作为外植体，接种到诱导培
养基上培养20～25d，带柄子叶两端生成愈伤组织与不定芽；其中，所述诱导培养基为MS+3mg/L 6
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BA +0.5mg/L IAA；S3. 继代培养：将步骤S2生成的愈伤组织与不定芽转移至继代培养基中培养15～20d，不定芽长至4～6cm；其中，所述继代培养基与诱导培养基相同；S4. 生根培养：将步骤S2或S3的不定芽切分下来接种到生根培养基中，培养2～3周长出5～8条根系；其中，所述生根培养基为MS＋0.2 mg/L IAA；S5. 炼苗移栽：待步骤S4的生根苗株高7～10cm，去瓶盖炼苗1～2d，将再生苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入品氏泥炭中，培养20～25d，移栽至室外。
[0007]进一步地，步骤S1中所述灭菌的方法为：75%乙醇浸泡1～2min，无菌水冲洗2次后，用10%（v/v）的次氯酸钠溶液震荡15～20min，用无菌水冲洗5～8次。
[0008]进一步地，步骤S2中所述带柄子叶的长度为0.5～1cm。
[0009]进一步地，步骤S1、S2、S3和S4培养的光照条件为：光照培养时间为16～18h，光照培养强度为3000～4000lux。
[0010]本专利技术具有以下优点：（1）本专利技术基于器官发生途径，以下垂辣椒带柄子叶为外植体，添加植物激素6
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BA与IAA，简化了下垂辣椒离体再生体系步骤，构建了稳定、高效的再生体系，且最高诱导率达到72%以上，为下垂辣椒的功能基因组研究和分子辅助育种提供了技术支持；（2）本专利技术建立了经过无菌苗带柄子叶诱导获得下垂辣椒的高效再生体系，提高了下垂辣椒再生率，为辣椒快繁与遗传转化提供技术支持。
[0011]（3）本专利技术能在较短时间内快速获得下垂辣椒再生植株，不受地区、季节、气候的限制，且遗传性状相对稳定，其再生体系的构建为下垂辣椒抗性的研究提供了种质资源材料，也为抗逆性基因的研究奠定基础。
[0012]（4）本专利技术构建和优化下垂辣椒离体再生体系，解决下垂辣椒离体再生体系效率低的难题，将对下垂辣椒的功能基因组学研究以及分子辅助育种发展提供巨大的推动力，可加快育种进程，缩短育种时间。
附图说明
[0013]图1为本专利技术的组织培养再生苗过程对比图：图中，A为下垂辣椒带柄子叶的外植体；B为外植体诱导的愈伤组织； C为愈伤组织进行分化形成不定芽；D
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E为不定芽继代培养为辣椒外植体诱导生根；F
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G为诱导生根的再生苗；H为移栽在人工气候室培养再生苗；I为移栽至基地的再生植株。
具体实施方式
[0014]下面结合附图及实施例对本专利技术做进一步的描述，本专利技术的保护范围不局限于以下所述：实施例1：一种下垂辣椒离体再生体系的构建方法，它包括以下步骤：S1. 无菌苗的获取：取下垂辣椒种子，用超纯水浸泡后75%乙醇浸泡1min，无菌水冲洗2次后，用10%（v/v）的次氯酸钠溶液震荡15min，用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干后接种到MS固体培养基上培养获得无菌苗；培养的光照条件为：光照培养时间为16h，光照培
养强度为3000lux；S2.诱导培养：将生长15d的无菌苗切取长度为0.5～1cm带柄子叶作为外植体，接种到诱导培养基上培养20d，带柄子叶两端生成愈伤组织与不定芽；其中，所述诱导培养基为MS+3mg/L 6
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BA +0.5mg/L IAA；培养的光照条件为：光照培养时间为16h，光照培养强度为3000lux；S3. 继代培养：将步骤S2生成的愈伤组织与不定芽转移至继代培养基中培养15d，培养的光照条件为：光照培养时间为16h，光照培养强度为3000lux；不定芽长至4～6cm；其中，所述继代培养基与诱导培养基相同；S4. 生根培养：将步骤S2或S3的不定芽切分下来接种到生根培养基中培养，培养的光照条件为：光照培养时间为16h，光照培养强度为3000lux，培养2周长出5～8条根系；其中，所述生根培养基为MS＋0.2 mg/L IAA；S5. 炼苗移栽：待步骤S4的生根苗株高7～10cm，去瓶盖炼苗1d，将再生苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入品氏泥炭中，培养20d，移栽至室外。
[0015]实施例2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种下垂辣椒离体再生体系的构建方法，其特征在于，它包括以下步骤：S1. 无菌苗的获取：取下垂辣椒种子，用超纯水浸泡后灭菌处理，所述灭菌的方法为：75%乙醇浸泡1～2min，无菌水冲洗2次后，用10%（v/v）的次氯酸钠溶液震荡15～20min，用无菌水冲洗5～8次，用无菌滤纸吸干后接种到MS固体培养基上获得无菌苗；S2.诱导培养：将生长15～25d的无菌苗切取带柄子叶作为外植体，接种到诱导培养基上培养20～25d，带柄子叶两端生成愈伤组织与不定芽；其中，所述诱导培养基为MS+3mg/L 6
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BA +0.5mg/L IAA；S3. 继代培养：将步骤S2生成的愈伤组织与不定芽转移至继代培养基中培养15～20d，不定芽长至4～6cm；...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪志伟，舒黄英，葛平飞，郝园园，成善汉，朱国鹏，
申请(专利权)人：海南大学三亚南繁研究院，
类型：发明
国别省市：