抗claudin18.2单克隆抗体制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种与claudin18.2特异性结合的抗体及其抗原结合片段。具体地，本发明专利技术所提供的一种特异性结合claudin18.2抗体或其抗原结合片段，具有高ADCC和CDC活性、与claudin18.2结合的高结合亲和力以及良好的体内抗肿瘤活性，在人类肿瘤治疗方面发挥重要作用。疗方面发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】
抗claudin18.2单克隆抗体


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种与claudin18.2特异性结合的抗体及其片段。

技术介绍

[0002]胃和食管的癌症在恶性肿瘤的治疗中是非常难于治疗的恶性肿瘤。胃癌在全球癌症死亡中位列第三，是一种难治性肿瘤，可选择的靶向药物较少，靶向治疗的疗效也欠佳，而且每年约有100万病例被确诊。尽管外科手术和新化疗方案均取得了很大的进步，但是5年生存率大约只有5％
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20％，晚期胃癌患者的中位总生存期(OS)约为10个月。患有这种癌症的患者急需一种创新药物来满足癌症治疗的需求。因此，寻找更有效的方法来延长胃癌患者的生命迫在眉睫。
[0003]密蛋白(Claudin)是上皮与内皮紧密连接内的整合膜蛋白(Integral Membrane Protein)，是一个多基因家族。Claudin蛋白在人体正常分化上皮性组织中表达定位于细胞膜，除了屏障结构形成的功能外，不同claudin表达具有组织特异性，表现出相应的功能特点。Claudin蛋白在细胞中的正常表达是稳定细胞之间相互作用动态平衡的前提条件，在细胞中的异常表达可破坏上皮细胞及内皮细胞的结构，并导致其功能受损，从而有利于肿瘤的发生、发展。
[0004]Claudin
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18(CLDN18)是一种在人类中由CLDN18基因编码的蛋白质，属于细胞紧密连接蛋白家族，是整合跨膜蛋白(四次跨膜蛋白)，其具有四个跨膜疏水区和两个细胞外环，其N末端和C末端均位于胞浆内，两个细胞外环使其成为理想的抗体靶点，可以控制层细胞之间的分子流动。Claudin18是位于上皮和内皮紧密连接中的整合膜蛋白，紧密连接在相邻细胞之间组织起颗粒互联的网，在紧密连接中，闭合蛋白和密蛋白是主要的跨膜蛋白组分，由于其强的细胞间粘附特性，他们产生了防止和控制溶质的细胞旁转运并限制膜脂和蛋白质侧向扩散以维持细胞极性的主要屏障，形成紧密连接的蛋白质关键性的参与了组织上皮组织结构，这些蛋白质在构造良好的上皮中几乎无法接近抗体，但在肿瘤细胞中开始暴露出来。
[0005]Claudin
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18具有两个剪接变体，分别为claudin18.1和claudin18.2，两者在包含第一个跨膜(TM)区和环1的N端部分中存在八个氨基酸的差异，而C端的蛋白质一级序列相同。Claudin18.1和claudin18.2的表达分布有所不同，claudin18.1在正常肺的细胞中选择性表达，claudin18.2在正常细胞中表达高度受限，但在多种肿瘤(胃癌、肺癌和胰腺癌等)中频繁异位激活和过表达。
[0006]Claudin18.2(CLDN18.2)是一种胃特异性膜蛋白，包含4个跨膜结构域和两个小细胞外环(环1被疏水区1和疏水区2包围，环2被疏水区3和疏水区4包围)，是高选择性胃谱系抗原，仅在短寿命的分化胃上皮细胞上表达，并且无法在正常人任何其他组织中检出，该抗原在包括胃食管癌和胰腺癌的多种人癌症中以显著水平异位表达(Sahin.U等，Clin cancer RES，2008.14(23)：第7624
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34页)。claudin18.2蛋白在胃癌的淋巴结转移和远处转
移中被频繁检出，被认为是胃癌和其他癌症类型的潜在治疗靶点，此靶点的发现也为胃癌的治疗提供了一种新的选择。CLDN18.2在癌细胞和正常细胞之间的差异表达、其膜定位、其在大多数毒性相关正常组织中不存在、其在胃中的表达局限在可通过胃的靶阴性干细胞来补充的非必要的细胞群体
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已分化的胃细胞，使得CLDN18.2成为癌症免疫治疗的有吸引力的靶标，并且在癌症治疗中使用靶向CLDN18.2的基于抗体的治疗剂(Therapeutics)使高水平的特异性治疗成为可能。
[0007]简单从细胞粘合机理看阻断claudin似乎会打碎细胞联合、加速肿瘤转移，也确实有研究显示阻断某些claudin会加速肿瘤转移。但是因为claudin18.2只在肿瘤细胞表达，所以可以比较安全地用抗体诱导细胞杀伤，制备针对claudin18.2的抗体，而不和claudin18.1结合，可以特异性的阻断肿瘤的claudin18.2的通路，具有广泛的应用。
[0008]Claudin18蛋白为4次跨膜蛋白，有claudin18.1和claudin18.2两个亚型，区别仅在其N端69个氨基酸，其余氨基酸完全一样，第7
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27位氨基酸还是跨膜区，制备只针对claudin18.2的抗体，选择1
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39位氨基酸为最好的选择。
[0009]IMAB362是首个靶向claudin18.2的嵌合型单克隆抗体，通过免疫效应机制激活介导特异性CLDN18.2
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阳性癌症细胞的杀伤。IMAB362是德国加尼梅德药物有限公司开发的针对claudin18.2的特异性的IgG1亚型单克隆抗体，高特异性的作用于claudin18.2的第一个细胞外结构域，并且不与包括claudin18.1在内的其它蛋白结合。
[0010]2016年6月3
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7日，一年一度的ACSO会议上也公布了其II期临床结果，对于晚期胃癌患者来说，当将这种新型，首创抗体IMAB362添加到标准化疗时，该药可以显著延长中位生存期，而且在预治疗胃癌患者中安全且可耐受。
[0011]在美国波士顿举行的CAR
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TCR峰会上，CAR
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T细胞免疫疗法研发企业科济生物公布了其在研CAR
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Claudin18.2 T细胞治疗胃癌/胰腺癌的临床数据。截止2018年8月31日，共入组并治疗了12例胃癌和胰腺癌晚期患者，入组时多名患者已有发生多器官转移；经过治疗，CAR
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T细胞在这些患者体内耐受良好；经过一段时间剂量和给药方式等摸索后，在最后采用优化给药方式的亚组，6名患者中有5名达到了客观缓解。其临床前数据也表明靶向claudin18.2的CAR
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T细胞在小鼠模型中可以完全清除胃肿瘤，且没有发生脱靶毒性。
[0012]专利CN109762067公布了一种结合人claudin18.2的抗体，该抗体能特异性的结合claudin18.2而不和claudin18.1结合，该抗体是通过噬菌体展示技术获得的，后期的蛋白成药性，蛋白稳定性方面有待探究。
[0013]WO2009/053041公布了Ganymed公司开发的claudin18.2 IgG1抗体，在治疗治疗胃食道癌晚期的1期和2期临床实验中表现出很好的效果。
[0014]目前对于胃癌，食道癌，胰腺癌等治愈非常差的肿瘤，急需开发一款合适的抗体，解决这个难题，本领域中仍然需要靶向claudin18.2、并作为该靶点激动剂的新型免疫治疗剂，调控细胞膜性质，控制物质交换，激活ADCC，从而提供更好的抗癌特性；仍需要新的抗CLDN18.2抗体，为治疗提供新的思路。我们针对clauidn1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗claudin18.2抗体或其抗原结合片段，其包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：1
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4，6
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9，30或其变体所示的重链CDR；和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：11，12，14，15，17，31
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33或其变体所示的轻链CDR。2.根据权利要求1所述的一种抗claudin18.2抗体或其抗原结合片段，其特征在于，该抗体或其抗原结合片段包含：(1)由SEQ ID NO：1，4或7之一所示的氨基酸序列构成的重链HCDR1；由SEQ ID NO：2，8或30之一所示的氨基酸序列构成的重链HCDR2；和由SEQ ID NO：3，6或9之一所示的氨基酸序列构成的重链HCDR3；和/或(2)由SEQ ID NO：31，32或33之一所示的氨基酸序列构成的轻链LCDR1；由SEQ ID NO：11或14之一所示的氨基酸序列构成的轻链LCDR2；和由SEQ ID NO：12，15或17之一所示的氨基酸序列构成的轻链LCDR3。3.根据权利要求2所述的一种抗claudin18.2抗体或其抗原结合片段，其特征在于，该抗体或其抗原结合片段包含选自下组的HCDR1、HCDR2和HCDR3：(1)SEQ ID NO：1所示的HCDR1、SEQ ID NO：2所示的HCDR2和SEQ ID NO：3所示的HCDR3，和/或(2)SEQ ID NO：4所示的HCDR1、SEQ ID NO：30所示的HCDR2和SEQ ID NO：6所示的HCDR3，和/或(3)SEQ ID NO：7所示的HCDR1、SEQ ID NO：8所示的HCDR2和SEQ ID NO：9所示的HCDR3；和/或选自下组的LCDR1、LCDR2和LCDR3：(4)SEQ ID NO：31所示的LCDR1、SEQ ID NO：11所示的LCDR2和SEQ ID NO：12所示的LCDR3，和/或(5)SEQ ID NO：32所示的LCDR1、SEQ ID NO：14所示的LCDR2和SEQ ID NO：15所示的LCDR3，和/或(6)SEQ ID NO：33所示的LCDR1、SEQ ID NO：11所示的LCDR2和SEQ ID NO：17所示的LCDR3。4.根据权利要求1
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3任一所述的一种抗claudin18.2抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包括HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其选自以下任意一组：序列如SEQ ID NO：1所示HCDR1，序列如SEQ ID NO：2所示HCDR2，序列如SEQ ID NO：3所示的HCDR3，序列如SEQ ID NO：31所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：11所示的LCDR2，序列如SEQ ID NO：12所示的LCDR3；序列如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，序列如SEQ ID NO：30所示的HCDR2，序列如SEQ ID ...

【专利技术属性】
技术研发人员：张贵民，赵丽丽，刘忠，李振宇，朱中松，李光艳，彭伟，张娜，王仕利，
申请(专利权)人：山东新时代药业有限公司，
类型：发明
国别省市：