一种银杏bZIP类转录因子GbbZIP08在促进植物类黄酮合成中的应用方法技术

本发明专利技术公开了一种银杏bZIP类转录因子GbbZIP08在促进植物类黄酮合成中的应用方法，属于植物分子基因工程技术领域，本发明专利技术从银杏中分离得到了编码GbbZIP08转录因子的完整cDNA，连接到植物过表达载体上，利用农杆菌介导转化植物，通过烟草瞬时表达证明了GbbZIP08定位于植物细胞核；分别利用花序侵染法和叶盘转化法获得了转基因拟南芥和转基因烟草，结果表明过表达GbbZIP08能够提高植株中类黄酮物质的积累。本发明专利技术为bZIP转录因子促进植物类黄酮合成的研究提供了一定的研究基础和基因资源。源。

【技术实现步骤摘要】
一种银杏bZIP类转录因子GbbZIP08在促进植物类黄酮合成中的应用方法


[0001]本专利技术属于植物分子基因工程
，具体涉及一种银杏bZIP类转录因子GbbZIP08在促进植物类黄酮合成中的应用方法。

技术介绍

[0002]银杏(Ginkgo biloba L.)为银杏科银杏属落叶乔木，是地球上最古老的孑遗植物，也是我国特有的药用植物资源。银杏叶提取物中的主要活性成分有类黄酮、萜内酯、长链酚类、原花色素、酚酸等化合物。其中，类黄酮在银杏叶提取物EGB中的含量在国际上被统一规定为24％，其具有增强免疫力、抗癌活性和抗衰老活性等作用，在预防和治疗心脑血管疾病等方面具有重要疗效。然而，多数银杏品种中的类黄酮含量极低，该因素已成为深入研究与开发银杏叶制剂的重要障碍。当前，利用基因工程技术针对次生代谢产物的关键调控因子进行遗传改良，对于提高银杏类黄酮的含量具有重要意义，目前未见关于银杏bZIP转录因子调控类黄酮代谢的相关报道。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是针对现有的问题，提供了一种银杏bZIP类转录因子GbbZIP08在促进植物类黄酮合成中的应用方法。
[0004]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0005]一种银杏bZIP类转录因子GbbZIP08在促进植物类黄酮合成中的应用方法，包括如下步骤：
[0006]步骤1：通过PCR扩增从银杏中克隆了GbbZIP08的基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示，经翻译得到其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；
[0007]步骤2：将步骤1中克隆到的基因序列进行一代测序获得GbbZIP08基因的碱基序列，进行后续基因序列分析和表达载体构建引物设计；
[0008]步骤3：通过Nimble cloning方法将克隆得到的GbbZIP08构建到pNC
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Cam1304
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SubC植物亚细胞定位载体和pNC
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Cam2304
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MCS35S植物过表达载体上；
[0009]步骤4：将步骤3构建的pNC
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Cam1304
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SubC
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GbbZIP08表达载体转化农杆菌GV3101，用于烟草瞬时转化，观察GbbZIP08在植物中的亚细胞定位，以空载体做为对照；
[0010]步骤5：将步骤3中的pNC
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Cam2304
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MCS35S
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GbbZIP08表达载体转化农杆菌，采用拟南芥花序侵染法转入拟南芥，采用烟草叶盘转化法转入烟草；
[0011]步骤6：采用抗性筛选获得转基因拟南芥纯合子，通过植物组培方法获得转基因烟草再生体系；使用阳性PCR、GUS染色和qRT
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PCR方法验证转基因植株；
[0012]步骤7：对步骤6获得的转基因植株和野生型植株进行类黄酮含量检测，分析过表达GbbZIP08在植物中对类黄酮合成的影响。
[0013]本专利技术相比现有技术具有以下优点：
[0014]本专利技术从银杏中分离得到了编码GbbZIP08转录因子的完整cDNA，连接到植物过表达载体上，利用农杆菌介导转化植物，通过烟草瞬时表达证明了GbbZIP08定位于植物细胞核；分别利用花序侵染法和叶盘转化法获得了转基因拟南芥和转基因烟草，结果表明过表达GbbZIP08能够提高植株中类黄酮物质的积累。本专利技术为bZIP转录因子促进植物类黄酮合成的研究提供了一定的研究基础和基因资源。
附图说明
[0015]图1为银杏8个组织中bZIP基因的FPKM值和总黄酮含量的相关性分析热图；
[0016]图2为GbbZIP08氨基酸序列的系统进化树分析结果图；
[0017]图3为pNC
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Cam1304
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SubC
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pNC
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GbbZIP08植物亚细胞定位载体和Cam2304MCS
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35S
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GbbZIP08过表达载体示意图；
[0018]图4为GbbZIP08的亚细胞定位结果图；
[0019]图5为转基因拟南芥纯合子筛选图；
[0020]图6为烟草遗传转化体系获得图；
[0021]图7为转基因植株阳性PCR鉴定结果图；
[0022]图8为转基因植株GUS染色图；
[0023]图9为转基因植株GbbZIP08定量分析结果图；
[0024]图10为转基因植株总黄酮含量分析结果图；
[0025]图11为转基因植株中山奈酚含量分析结果图；
[0026]图12为转基因植株花青素含量分析结果图。
具体实施方式
[0027]下面将结合本专利技术中的实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0028]实施例
[0029]一种银杏bZIP类转录因子GbbZIP08在促进植物类黄酮合成中的应用方法，包括如下步骤：
[0030](1)银杏bZIP基因家族的筛选与鉴定：
[0031]基于银杏基因组数据库，利用本地blast从中筛选得到40条GbbZIP基因；结合银杏8个组织的转录组数据和类黄酮含量的相关性分析；
[0032]发现GbbZIP08基因和银杏类黄酮含量存在高度的正相关性(图1)；
[0033]进化树分析显示GbbZIP08是拟南芥类AtbZIP56的同源基因(图2)；
[0034](2)银杏中GbbZIP08基因序列获得：
[0035]取新鲜的银杏叶置于液氮预冷的研钵中进行研磨，根据RNA提取试剂盒(TaKaRa)说明书提取植物RNA，提取完成后使用凝胶电泳检测RNA完整性，NanoDrop仪器检测RNA浓度，经检测合格的RNA样品使用RNA反转录试剂盒(Vazyme)进行反转录，根据产品说明书合成cDNA；
[0036]根据银杏基因组中GbbZIP08的CDs序列设计克隆引物(U：ATGGCTTTTGGAGATCTCAG；D：TTAAGGTACCTGTCTAAGCATG)；
[0037]通过PCR扩增目的基因，纯化回收，使用TA克隆将目的基因连到T载体上，转化至大肠杆菌感受态，挑取单克隆用M13引物进行菌液PCR验证，将阳性克隆菌液一部分用50％甘油保存备用，一部分送至上海生工生物公司测序获得基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示；
[0038](3)银杏中GbbZIP08表达载体构建：
[0039]设计载体构建引物(U：AGTGGTCTCTGTCCAGTCCTATGGCTTTTGGAGATCTCAG；D：GGTCTCAGCAGACCACAA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种银杏bZIP类转录因子GbbZIP08在促进植物类黄酮合成中的应用方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：通过PCR扩增从银杏中克隆了GbbZIP08的基因序列如序列表SEQ IDNO.1所示，经翻译得到其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；步骤2：将步骤1中克隆到的基因序列进行一代测序获得GbbZIP08基因的碱基序列，进行后续基因序列分析和表达载体构建引物设计；步骤3：通过Nimble cloning方法将克隆得到的GbbZIP08构建到pNC
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Cam1304
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SubC植物亚细胞定位载体和pNC
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Cam2304
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MCS35S植物过表达载体上；步骤4：将步骤3构建的pNC
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C...

【专利技术属性】
技术研发人员：许锋，叶家保，韩欢，李宇婷，张威威，廖咏玲，陈强文，郑嘉瑞，
申请(专利权)人：长江大学，
类型：发明
国别省市：