本发明专利技术涉及遗传转化技术领域，具体涉及一种提高葫芦科作物瞬时表达和遗传转化效率的方法。该方法包括采用碳纳米管和农杆菌协同侵染葫芦科作物外植体的步骤，所述农杆菌中含有包含目的基因的质粒载体。本发明专利技术将碳纳米管应用到农杆菌介导的葫芦科作物遗传转化体系中，能够很好的促进农杆菌将目的基因转化至葫芦科作物外植体，实现一周左右的瞬时表达。实现一周左右的瞬时表达。实现一周左右的瞬时表达。
【技术实现步骤摘要】
一种提高葫芦科作物瞬时表达和遗传转化效率的方法
[0001]本专利技术涉及遗传转化
，具体涉及一种提高葫芦科作物瞬时表达和遗传转化效率的方法。
技术介绍
[0002]黄瓜是典型的葫芦科作物，目前葫芦科作物的遗传转化一直是世界性的难题。农杆菌介导法是目前葫芦科作物中最成熟的遗传转化方法，但是一方面因为农杆菌具有较强的宿主特异性导致农杆菌对外植体的侵染强度不高，而侵染强度是遗传转化中的关键因素，另一方面农杆菌对外植体具有致病性，在侵染过程中容易造成外植体褐化，后期管理中也容易发生溢菌，很难得到阳性植株，这也使得农杆菌遗传转化体系虽经过长期的发展，但在黄瓜中的转化效率也仅仅只有0.1％，因此，如何提高葫芦科作物的遗传转化效率，是葫芦科作物生物学研究和分子育种中最大的技术瓶颈之一。
技术实现思路
[0003]针对现有技术所存在的技术问题，本专利技术提供了一种提高葫芦科作物瞬时表达和遗传转化效率的方法，该方法将碳纳米管与农杆菌遗传转化体系结合，能够很好的促进农杆菌在葫芦科作物中的遗传转化。
[0004]本专利技术采用如下技术方案来实现上述技术目的：
[0005]本专利技术提供一种提高葫芦科作物瞬时表达和遗传转化效率的方法，包括采用碳纳米管和农杆菌协同侵染葫芦科作物外植体的步骤，所述农杆菌中含有包含目的基因的质粒载体。
[0006]优选的，所述碳纳米管和农杆菌混合后再侵染葫芦科作物外植体；或，先采用农杆菌侵染葫芦科作物外植体，再采用碳纳米管二次侵染；或，先采用碳纳米管侵染葫芦科作物外植体，再采用农杆菌二次侵染。
[0007]优选的，所述碳纳米管上装载有包含目的基因的质粒载体。
[0008]优选的，碳纳米管和农杆菌在真空负压条件下侵染葫芦科作物外植体。
[0009]优选的，葫芦科作物外植体在两次真空负压的条件下完成遗传转化。
[0010]优选的，所述葫芦科作物为黄瓜，所述黄瓜外植体的制备包括以下步骤：取籽粒饱满、大小均一的黄瓜种子，于50～60℃温水中浸种半小时以上，除去种皮，在超净工作台中先用酒精清洗，再用NaClO溶液浸泡，最后用无菌水冲洗干净后转移至种子萌发培养基上，暗培养至萌发，切弃已萌发的种子远端1/2的子叶，去掉下胚轴，将两片子叶分开，每片子叶在近端会形成一个U型的伤口，即每粒种子得到2个外植体。
[0011]优选的，将干燥的COOH
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SWCNT粉混入纯水中，调节pH后，水浴超声、细胞破碎仪处理后转移至PEI溶液中，在反应釜中85℃反应24h，冷却至室温，透析、蒸发浓缩和多次离心后收集即得。
[0012]优选的，装载有质粒的碳纳米管侵染液的制备包括以下步骤：将碳纳米管与载体
按照(1～3):1的质量浓度比混合后孵育半小时，孵育完成后，加入IM培养基，即得。
[0013]优选的，真空负压遗传转化的方法包括：将切好的外植体放入IM液体培养基中，水浴超声处理后，倒掉IM培养基后将外植体与侵染液混合，加至医用注射器针筒中，缓缓套入活塞杆并排空气泡和多余的空气，用橡胶皮塞密封头部针孔，向后方用于地缓缓拔动活塞芯杆，对侵染液和外植体施加真空负压一段时间，并轻轻晃动针筒，即完成一次真空负压遗传转化。
[0014]优选的，碳纳米管侵染时的终浓度为300μg/L～1mg/L。
[0015]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0016](1)本专利技术将碳纳米管应用到农杆菌介导的葫芦科作物遗传转化体系中，能够很好的促进农杆菌将目的基因转化至葫芦科作物外植体中，实现一周左右的瞬时表达；
[0017](2)当将碳纳米管直接添加到农杆菌侵染液中进行侵染或者是先采用装载有目的基因质粒的碳纳米管侵染，再采用农杆菌侵染时，两者表现出明显的协同侵染效应，且先采用装载质粒的碳纳米管预处理后再采用农杆菌进行侵染，最终可以将黄瓜遗传转化效率提高约1.6％。
附图说明
[0018]图1为本专利技术实施例1中碳纳米管装载质粒DNA前后的粒径大小，其中a为装载前碳纳米管的粒径，b为装载后碳纳米管的粒径；
[0019]图2为本专利技术实施例2中不同碳纳米管浓度下培养12h农杆菌的OD值；
[0020]图3为本专利技术实施例3中共培养4d外植体的GFP荧光强度，其中a为农杆菌和碳纳米管的侵染强度，b为GFP总荧光强度；
[0021]图4为本专利技术实施例3中CNT介导黄瓜瞬时转化评估，其中a为10d和20d时外植体的GFP荧光图像，b为4d、10d和30d时外植体存活率的变化，c为4d、10d和30d时含有荧光的外植体比率；
[0022]图5为本专利技术实施例4中共培养4d外植体GFP荧光强度的比较，其中a为不同侵染处理的侵染效果，b为GFP总荧光强度。
[0023]图6为本专利技术实施例4中荧光再生芽的电镜照片，其中a为3周时的结果，b为4周时的结果。
具体实施方式
[0024]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本专利技术。
[0025]以下各实施例，仅用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。基于本专利技术中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本专利技术的保护范围。
[0026]在本专利技术实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本专利技术实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0027]实施例1试剂、材料准备及检测分析方法
[0028]实验中所用的载体及培养基：
[0029]pBSE403载体：以pBSE401载体为基础进行改造，在EcoRI位点插入d35S：GFP：terminator，详细可参见论文《An efficient root transformation system for CRISPR/Cas9
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based analyses of shoot
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root communication in cucurbit crops》。
[0030]MS固体培养基：称取4.43g MS粉、30g蔗糖、3g植物凝胶，定容至1L，用KOH将pH调至5.7
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5.8，121℃高压灭菌15min。加入相应体积的化学试剂配制成以下各类培养基。
[0031]种子萌发培养基：MS固体培养基中加入2mg/L 6BA(6
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苄氨基嘌呤)和1mg/L ABA(脱落酸)。
[0032]IM液体培养基：MS液体培养基中加入2mg/L 6BA(6
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苄氨基嘌呤)、1mg/L ABA(脱落酸)、80mg/L AS(乙酰丁香酮)和12.5μM MES(2
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吗啉乙磺酸)。
[0033]共培养培养基：MS固体培养基中加入2mg/L 6BA(6
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苄氨基嘌呤)、1mg/L ABA(脱落酸)本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种提高葫芦科作物瞬时表达和遗传转化效率的方法，其特征在于，包括采用碳纳米管和农杆菌协同侵染葫芦科作物外植体的步骤，所述农杆菌中含有包含目的基因的质粒载体。2.根据权利要求1所述的提高葫芦科作物瞬时表达和遗传转化效率的方法，其特征在于，所述碳纳米管和农杆菌混合后再侵染葫芦科作物外植体；或，先采用农杆菌侵染葫芦科作物外植体，再采用碳纳米管二次侵染；或，先采用碳纳米管侵染葫芦科作物外植体，再采用农杆菌二次侵染。3.根据权利要求1或2所述的提高葫芦科作物瞬时表达和遗传转化效率的方法，其特征在于，所述碳纳米管上装载有包含目的基因的质粒载体。4.根据权利要求1所述的提高葫芦科作物瞬时表达和遗传转化效率的方法，其特征在于，碳纳米管和农杆菌在真空负压条件下侵染葫芦科作物外植体。5.根据权利要求4所述的提高葫芦科作物瞬时表达和遗传转化效率的方法，其特征在于，葫芦科作物外植体在两次真空负压的条件下完成遗传转化。6.根据权利要求1所述的提高葫芦科作物瞬时表达和遗传转化效率的方法，其特征在于，所述葫芦科作物为黄瓜，黄瓜外植体的制备包括以下步骤：取籽粒饱满、大小均一的黄瓜种子，于50～60℃温水中浸种半小时以上，除去种皮，先用酒精清洗，再用NaClO溶液浸泡，最后用无菌水冲洗干净后转移至种子萌发培养基上，暗培养至萌发，切弃已萌发的种子远端1/2的子叶，去掉下胚...
【专利技术属性】
技术研发人员：别之龙，吴洪洪，崔履军，姚雪，杨丽，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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