一种玻璃化冷冻外泌体保存方法技术

本发明专利技术涉及一种玻璃化冷冻外泌体的保存方法。申请人首次发现N

【技术实现步骤摘要】
一种玻璃化冷冻外泌体保存方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种玻璃化冷冻外泌体保存方法。

技术介绍

[0002]骨是体内一个代谢十分活跃的器官，在整个生命周期中通过成骨细胞(Osteoblast，OB)与破骨细胞(Osteoclast，OC)相互作用不断地进行着吸收与重建。骨的重建对于调节和维持骨骼完整性相当重要，两者协调失衡就会出现病理性骨质缺损或异常的新骨再生。
[0003]破骨细胞是一种来源于骨髓单核巨噬细胞系的高度分化的终末细胞，也是唯一一种具有骨吸收功能的细胞，在生理性骨重建和病理性骨吸收中具有重要作用。破骨细胞增多或活性增强，就会导致骨吸收增加，骨重塑失衡，从而引发很多骨骼系统疾病，如：骨质疏松、类风湿关节炎、转移性骨肿瘤等。
[0004]破骨细胞(OC)是一种没有突起的多核大细胞，直径为30
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100μm，有数十个甚至多达上百个细胞核，其胞核多呈圆形，核膜平整，染色质颗粒分布均匀，着色较浅，内有1
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2个核仁。幼稚OC的胞浆呈嗜碱性，成熟后的OC其胞浆呈嗜酸性，并随着细胞的老化胞浆的嗜酸性不断增强。通常胞浆内有丰富的线粒体以及大量的溶酶体与游离的核糖体。
[0005]OPG(骨保护素)/RANK(核因子κB受体活化因子)/RANKL(核因子κB受体活化因子配体)系统是在细胞外调节OC分化、成熟和凋亡的一个重要信号调节系统。OPG/RANK/RANKL系统不仅参与生理性骨重建，同样与病理状态下的骨质吸收也有着密切的关系。RANKL与破骨细胞膜上的RANK结合是破骨前体细胞成熟并进一步向功能性的破骨细胞分化以及发挥骨吸收活性的必须条件。
[0006]核因子
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кB受体活化因子(RANK,receptor activator of nuclear factor.кB)为I型跨膜蛋白，属于TNF家族成员，RANK高度表达于许多细胞表面，如破骨前体细胞、成熟破骨细胞、哺乳动物腺体上皮细胞、树突状细胞及某些癌细胞之中，如：乳腺癌和前列腺癌，此两种癌症都有很高的骨转移风险。虽然直到现在还没有发现人类存在RANK突变和失活的现象，但RANK自发突变的转基因小鼠与靶向敲除RANK的小鼠表型特征完全相同，证明RANK对破骨细胞形成的重要性。
[0007]核因子
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кB受体活化因子配体(RANKL，receptor activator of nuclear factor
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кB ligand)属于II型同源三聚体跨膜蛋白，有膜结合型和分泌型两种。RANKL高表达于淋巴结、肺和胸腺中，但在骨髓及脾脏中低表达。RANKL的表达受到多种细胞因子以及激素的调节，如甲状旁腺素、1，25二羟维生素D3、前列腺素E2。
[0008]巨噬细胞集落刺激因子(M
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CSF)和RANKL对于启动OC分化时的基因转录是必不可少的，二者有互补作用。M
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CSF可以增加破骨前体细胞池，RANKL则结合到破骨前体细胞及成熟OC表面表达的RANK受体上，促进OC的分化、活化同时抑制其凋亡，许多因子主要通过间接上调OB和其他细胞中M
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CSF和RANKL的表达进而促进骨吸收。有研究已经发现RANKL对风湿性关节炎患者的关节损伤有一定的作用。
[0009]在骨吸收的过程中，OB在骨吸收因子的刺激下分泌RANKL，RANKL与M
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CSF结合到破骨前体细胞表面受体RANK和M
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CSFR上，RANK胞内区的特异性位点首先与OC内的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(TNF Receptor Associated Factors，TRAFs)结合，TRAFs6与RANK的结合对于破骨前体细胞和OC有重要作用，敲除TRAFs6基因的小鼠表现出骨硬化症。
[0010]一些适配子与TRAFs一起结合到RANK的胞内区后，诱导核因子кB通路(Nuclear factor
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kappa B，NF
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кB)或C—JUN末端激酶活化，NF
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кB能增加c
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Fos基因的表达，c
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Fos与NFATcl结合后启动OC特异性基因的转录，从而使破骨前体细胞分化成成熟的OC,从而发挥骨吸收功能。
[0011]RANKL可能是唯一能够直接诱导破骨细胞分化的细胞因子，大多数骨代谢调节因子都是间接诱导破骨细胞分化，通过一定的信号传导途径诱导成骨/基质细胞表达RANKL，RANKL是直接联系成骨/基质细胞与前体破骨细胞相互作用的破骨分化因子。而诱发破骨的同时，OB还可以分泌OPG，以旁分泌的方式发挥破骨抑制作用。OPG与RANKL结合阻断OB到OC的信号传递，抑制了OC的分化和成熟，同时诱导OC凋亡。
[0012]实验证实，RANK基因敲除鼠由于OC减少，会出现严重的非致命性石骨症。所以，OPG可以抑制OC分化成熟。因此正常的骨重建和骨量的稳定依赖于OPG和RANKL之间的平衡。
[0013]破骨细胞前体细胞(Osteoclast precursor cell，OPC)来源于造血细胞，其分化的破骨细胞是由单核细胞祖细胞融合后形成的一种多核细胞。巨噬细胞和破骨细胞有很多共同特点，两者表达部分共同抗原，但其表面抗原或标志物如巨噬细胞表面蛋白(macrophage，Mac)
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l,2以及粒细胞(granulocyte，Gr)
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1却有明显的差异，表明这是两种不同类型的细胞。
[0014]已有研究证实巨噬细胞变成具有骨吸收能力的破骨细胞须有骨髓基质细胞/成骨细胞存在，因其作为辅助细胞，可以表达巨噬细胞集落刺激因子(M
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CSF)和RANKL这两个促进破骨细胞形成所必须的分子。M
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CSF和RANKL与破骨细胞前体细胞(巨噬细胞)上的M
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CSF受体和RANK分别结合，发出使巨噬细胞变为破骨细胞的信号，使其存活并增殖。研究表明，破骨细胞生成的信号传导必须发生在破骨细胞的前体细胞和基质细胞或成骨细胞相互接触的情况下，因为基质细胞或成骨细胞产生的RANKL和破骨细胞产生的RANK都位于细胞表面。表达髓系树突细胞早期标志物的细胞，也可分化成破骨细胞，可呈递抗原至T
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淋巴细胞的比较成熟的树突细胞，有在体外形成破骨细胞的能力。早有实验证实，一个共同的干细胞可分化为巨噬细胞、破骨细胞和髓系树突细胞，树突细胞在M
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CSF和RANKL刺激下亦可分化为破骨细胞。
[0015]小鼠单核巨噬细胞瘤RAW264.7细胞是用Abelson鼠白血病病毒诱导BALB/c小鼠发生肿瘤后，收集小鼠腹水单核样巨噬细胞得到的细胞株，诱导后可获得成熟的破骨细胞。RAW264.7细胞贴壁生长紧密，多种培养基均适合其生长。RT
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PCR结果表明，RAW26本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.N
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甲基吡咯烷酮作为外泌体冷冻保护剂的用途。2.一种外泌体冷冻保护剂，其特征在于，由等体积乙二醇、二甲基亚砜和N
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甲基吡咯烷酮和外泌体专用无血清培养基组成。3.如权利要求2所述的冷冻保护剂，其特征在于，乙二醇、二甲基亚砜和N
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甲基吡咯烷酮的加入比例均为20％。4.如权利要求3所述的冷冻保护剂，其特征在于，制备方法如下：在容量瓶中依次加入20ml乙二醇，20ml二甲基亚砜，20mlN
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甲基吡咯烷酮，以外泌体专用无血清培养基定容至100ml，摇匀即得。5.一种玻璃化冷冻外泌体的保存方法，其特征在于，以权利要求1
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4所述任一冷冻保护剂为保护剂。6.如权利要求5所述的玻璃化冷冻外泌体的保存方法，其特征在于，步骤如下：步...

【专利技术属性】
技术研发人员：张贤祚，王加兴，杨宁，朱万博，葛无非，朱晨，方诗元，
申请(专利权)人：‑，
类型：发明
国别省市：