一种基于表面增强拉曼散射成像的免疫层析试条T线的高灵敏识别方法技术

本发明专利技术涉及一种基于表面增强拉曼散射成像的免疫层析试条T线的高灵敏识别方法。所述基于表面增强拉曼散射成像的免疫层析试条包括：依次相互搭接的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；其中，标记有拉曼报告分子和新型冠状病毒蛋白抗体的金纳米星作为免疫层析试条金标垫上的SERS探针；从样品垫到所述吸收垫的方向上，所述硝酸纤维素膜上依次设置有检测线T线和质控线C线。线T线和质控线C线。线T线和质控线C线。

【技术实现步骤摘要】
一种基于表面增强拉曼散射成像的免疫层析试条T线的高灵敏识别方法


[0001]本专利技术涉及侧流免疫层析技术检测抗原和表面增强拉曼散射成像领域，具体涉及一种侧流免疫层析技术与表面增强拉曼散射成像结合的方法来识别层析试条T线，以检测 SARS
‑
CoV
‑
2阴/阳性的方法。

技术介绍

[0002]常规检测方法如核酸检测，虽然灵敏度高但耗时较长(≥2h)，而且需要专业的设备、人员以及昂贵的化学试剂。其它检测方法如抗体检测和抗原检测，虽然能在一定程度上起到筛查的作用，检测时间15
‑
30min，但是在使用时也面临着不足，如灵敏度比PCR核酸检测差两个数量级，在患者感染早期难以准确诊断。
[0003]表面增强拉曼光谱(SERS)是一种高灵敏度光谱分析方法，可以无损检测和识别特征分子的化学结构，具有检测单个生物细胞的能力。厦门大学通过新冠病毒SARS
‑
CoV
‑
2S蛋白免疫磁珠捕获纳米粒子与S蛋白发生特异性免疫之后，与免疫金信号纳米粒子孵育，构筑成三明治夹心结构，然后通过拉曼光谱仪，可直接测出其SERS信号，在5分钟内特异性检测出新冠病毒SARS
‑
CoV
‑
2蛋白，其灵敏度可达5*105Tu/mL。
[0004]但是，目前SERS结合侧流免疫层析方法在检测阳性样本时多采取直接检测T线上的信号与阴性样本T线的信号对比。当病毒载量较高时，该方法可以快速、准确地识别阳性样本；当病毒载量较低时，直接对比阴性和阳性样本的T线信号会面临准确性不足的问题。一方面，金纳米颗粒在T线上随机团聚可能会带来个别位置信号的急剧变强；另一方面，T 线上的捕获抗体与金纳米颗粒可能会存在少量的非特异性结合，这也可能使拉曼信号突然增强，从而造成假阳性的出现。而且，病毒载量较低时，无法通过显色观察T线的位置，需要刻意找寻T线的位置，尤其是T线位置的信号增强不明显时，会使得识别T线信号更加困难。以上，限制了SERS结合侧流免疫层析技术检测灵敏度的进一步提高。

技术实现思路

[0005]针对上述问题，本专利技术提供一种基于表面增强拉曼成像技术识别免疫层析试条T线的方法，通过扫描层析试条T线周围的拉曼信号来成像，根据成像特点来判断样本的阴/阳性。该方法准确度高，灵敏度高，速度快，极大的减少了假阳性的出现，对于层析试条的信号识别具有极大的推广和应用价值。
[0006]具体来说，第一方面，本专利技术提供了一种基于表面增强拉曼散射成像的免疫层析试条，包括：依次相互搭接的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；其中，标记有拉曼报告分子和新型冠状病毒蛋白抗体的金纳米星作为免疫层析试条金标垫上的SERS探针；从样品垫到所述吸收垫的方向上，所述硝酸纤维素膜上依次设置有检测线T线和质控线C线。
[0007]较佳地，所述标记有拉曼报告分子和新型冠状病毒蛋白抗体的金纳米星的结构由内至外包括：Au纳米星、以及修饰在Au纳米星表面的由拉曼报告分子标记的新型冠状病毒
蛋白抗体；优选地，所述金纳米星具有长20～50nm、宽10～20nm的触突结构，整体粒径为30～100 nm；所述拉曼报告分子为4
‑
巯基苯甲酸(4
‑
MBA)、或者5,5'
‑
二硫代双(2
‑
硝基苯甲酸)(DTNB) 中的一种。
[0008]较佳地，所述标记有拉曼报告分子和新型冠状病毒蛋白抗体的金纳米星溶胶的UV
‑ꢀ
Vis吸收峰位置为750
±
50nm。
[0009]较佳地，所述标记有拉曼报告分子和新型冠状病毒蛋白抗体的金纳米星的制备方法为：向金纳米星溶液中加入拉曼报告分子标记的新型冠状病毒蛋白抗体，于4～25℃下孵育 6～12小时；离心并收集产物，将所述产物重新溶解后，加入牛血清白蛋白BSA溶液，于 4～25℃下孵育2～6小时可得。
[0010]较佳地，将结合垫浸渍于标记有拉曼报告分子和新型冠状病毒蛋白抗体的金纳米星溶液中，干燥，得到金标垫；所述标记有拉曼报告分子和新型冠状病毒蛋白抗体的金纳米星溶液中，金纳米星颗粒的浓度为10
10
～10
12
particles/mL，所述拉曼报告分子的浓度为10
‑3～ 10
‑5M，所述新型冠状病毒蛋白抗体的浓度为2～10μg/mL。
[0011]较佳地，所述检测线T线为新型冠状病毒蛋白抗体稀释至1～5mg/mL后进行划线得到，划液量为0.5～5μL/cm，划膜速度为50～100mm/s；所述的质控线C线为羊抗鼠IgG 稀释至5～10mg/mL后进行划线得到，划液量为0.5～5μL/cm，划膜速度为50～100 mm/s。
[0012]较佳地，所述检测线T线和质控线C线的间距为1～2cm；所述C线宽度为200～ 500μm，所述T线宽度为200～500μm。
[0013]第二方面，本专利技术提供了一种非诊断和治疗目的基于表面增强拉曼散射成像的免疫层析试条T线识别方法，包括：(1)在病毒裂解液中分别配置不同浓度的新型冠状病毒蛋白溶液用于所述基于表面增强拉曼散射成像的免疫层析试条上，进行免疫层析，通过便携式拉曼光谱检测层析试条的T线及所述T线周围的拉曼信号；以探针分子最强的拉曼特征峰在T线附近进行Mapping成像；(2)通过判断成像后图像的特点，以及成像区域内拉曼信号最强值和最弱拉曼强度的差值，判断T线是否存在病毒抗原。
[0014]较佳地，Mapping成像区域为以T线的几何中心作为扫描中心位置，形成1mm≤X ≤3mm，0.2mm≤Y≤3mm的矩形区域；X方向为T线划膜方向；Y方向为液体流动方向。
[0015]较佳地，控制X方向的扫描步长l
x
≤200μm，优选为50μm≤l
x
≤200μm；Y方向的扫描步长l
y
≤Y/3，优选为Y/10≤l
y
≤Y/3。
[0016]较佳地，便携式拉曼光谱的功率为20～100mW，单点积分时间为0.5～2秒。
[0017]较佳地，阳性试条T线处的成像特点包括：(1)X方向上仅存在一条强度≥2000且边界清晰的色带；(2)所述色带像素点≥2且宽度≥2l
x
；(3)所述色带在Y方向上强度差值≤5000；(4)所述色带上的拉曼信号最强值与成像区域内的最弱信号的差值I
max
‑
I
min
≥1500。
[0018]较佳地，阴性试条T线处的成像特点包括：
(1)X方向上存在若干条强度高于周围的色带，并且色带边界不清晰；(2)所述色带像素点＜2且宽度＜2l
x
，或者无明显的色带；(3)所述色带上的拉曼信号最强值与成像区域内最弱信号的差值I
max
‑
I
min
≤3000。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于表面增强拉曼散射成像的免疫层析试条，其特征在于，包括：依次相互搭接的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；其中，标记有拉曼报告分子和新型冠状病毒蛋白抗体的金纳米星作为免疫层析试条金标垫上的SERS探针；从样品垫到所述吸收垫的方向上，所述硝酸纤维素膜上依次设置有检测线T线和质控线C线。2.根据权利要求1所述的基于表面增强拉曼散射成像的免疫层析试条，其特征在于，所述标记有拉曼报告分子和新型冠状病毒蛋白抗体的金纳米星的结构由内至外包括：Au纳米星、以及修饰在Au纳米星表面的由拉曼报告分子标记的新型冠状病毒蛋白抗体；优选地，所述金纳米星具有长20～50 nm、宽10～20 nm的触突结构，整体粒径为30～100 nm；所述拉曼报告分子为4
‑
巯基苯甲酸(4
‑
MBA)、或者5,5'
‑
二硫代双(2
‑
硝基苯甲酸)(DTNB)中的一种。3.根据权利要求1或2所述的基于表面增强拉曼散射成像的免疫层析试条，其特征在于，所述标记有拉曼报告分子和新型冠状病毒蛋白抗体的金纳米星溶胶的UV
‑
Vis吸收峰位置为750
±
50 nm。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的基于表面增强拉曼散射成像的免疫层析试条，其特征在于，所述标记有拉曼报告分子和新型冠状病毒蛋白抗体的金纳米星的制备方法为：向金纳米星溶液中加入拉曼报告分子标记的新型冠状病毒蛋白抗体，于4～25℃下孵育6～12小时；离心并收集产物，将所述产物重新溶解后，加入牛血清白蛋白BSA溶液，于4～25℃下孵育2～6小时可得。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的基于表面增强拉曼散射成像的免疫层析试条，其特征在于，将结合垫浸渍于标记有拉曼报告分子和新型冠状病毒蛋白抗体的金纳米星溶液中，干燥，得到金标垫；所述标记有拉曼报告分子和新型冠状病毒蛋白抗体的金纳米星溶液中，金纳米星颗粒的浓度为10
10
～10
12 particles/mL，所述拉曼报告分子的浓度为10
‑3～10
‑
5 M，所述新型冠状病毒蛋白抗体的浓度为2～10μg/mL。6.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的基于表面增强拉曼散射成像的免疫层析试条，其特征在于，所述检测线T线为新型冠状病毒蛋白抗体稀释至1～5 mg/mL后进行划线得到，划液量为0.5～5μL/cm，划膜速度为50～100 mm/s；所述的质控线C线为羊抗鼠IgG稀释至5～10 mg/mL后进行划线得到，划液量为0.5～5μL/cm...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨勇，林成龙，赵帅，黄政仁，
申请(专利权)人：中国科学院上海硅酸盐研究所，
类型：发明
国别省市：