实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器及其应用，纳米传感器包括基底结构和传感单元；所述基底结构为由四条单链DNA经碱基互补配对形成的四面体框架结构，并能穿越活细胞膜；四个所述传感单元分别连接在所述基底结构的四个端点处；所述传感单元包括在ATP参与下发生分子置换反应的碱基对；所述传感单元发生分子置换之前，传感单元在特定波长的激发光照射下无荧光信号发出；所述传感单元发生分子置换之后，传感单元能在特定波长的激发光照射下发出荧光信号。本发明专利技术的一个技术效果在于，结构设计合理，其能够在不毒性损伤活细胞的前提下实时监测活细胞内ATP动态变化，操作方便。操作方便。操作方便。

【技术实现步骤摘要】
实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器及其应用


[0001]本专利技术属于活细胞内ATP动态变化的监测
，具体涉及一种实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器及其应用。

技术介绍

[0002]作为细胞内的能量货币，三磷酸腺苷 (ATP) 在许多细胞过程中例如细胞凋亡、细胞坏死和细胞毒性状态均起着关键作用。ATP是一种重要的调节因子，可以动态调节细胞活力和代谢活性。细胞内ATP的异常变化与许多疾病的发生和发展有关。因此，检测细胞内ATP的变化不仅可以作为基因通路或细胞生长状态的测量手段，而且可以作为追踪疾病进展和治疗效果的有效追踪工具。
[0003]各种检测ATP方法的出现，促进了ATP检测试剂盒的商业化。但其在使用之前需要溶解细胞，只能检测到某时某刻下细胞的ATP值。显而易见，此种方法是非常不灵活的。这种方法有一个重要的缺陷，就是不能检测活细胞中ATP值的变化。而无论是在前沿研究中，还是重大疾病的监测诊疗中，细胞内ATP的变化是一直在持续发生的。传统的ATP检测试剂盒对于实时监测活细胞内ATP的动态变化是难以实现的。
[0004]目前，尚无在活细胞中长期实时监测活细胞内ATP的公开技术。但是，在细胞系中进行实时的ATP监测主要有以下两类技术：（1）特异性针是对ATP检测的各类荧光探针，通过与各类化合物的结合，而识别细胞内特定细胞器，例如溶酶体线粒体等，其荧光强度根据ATP与荧光探针在特定基团或化学键上的结合而变化，从而指示出检测到的细胞内的ATP。但是这类方法有较大的三个缺陷。首先由于引入了外来的化合物成分，导致其会造成不同程度的细胞损伤。浓度越高，或者其在活细胞内孵育的时间越久，损伤就越严重。其次这些荧光探针能够进入细胞的效率不高，导致其有大部分无法进入到细胞内部，检测效率较低。最后荧光探针极容易造成脱靶现象，特异性不强，且价格昂贵，从而造成荧光探针应用率不高。上述的缺陷决定了这种方式无法大规模的进行应用，因此只能用于有限的科研场合。
[0005]（2）ATP靶向适配体与各种纳米材料的结合，极大地解决了上述第一种方法中特异性不强以及进入细胞的通透性低的问题。但这种方法的致命缺陷在于：同第一种方法一样，由于引入了外来的纳米材料的成分，造成了整体结构与细胞的生物相容性低，因此不可避免对细胞带来一定程度的损伤。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器及其应用的新技术方案。
[0007]根据本专利技术的第一方面，提供了一种实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器，包括：基底结构，所述基底结构为由四条单链DNA经碱基互补配对形成的四面体框架结
构，并能穿越活细胞膜；传感单元，四个所述传感单元分别连接在所述基底结构的四个端点处；所述传感单元包括在ATP参与下发生分子置换反应的碱基对；所述传感单元发生分子置换之前，传感单元在特定波长的激发光照射下无荧光信号发出；所述传感单元发生分子置换之后，传感单元能在特定波长的激发光照射下发出荧光信号。
[0008]可选地，四条单链DNA的摩尔数相同。
[0009]可选地，所述传感单元由具有荧光基团修饰的ATP适配体核酸链与具有淬灭基团修饰的短链通过碱基互补配对结合而成；所述传感单元通过ATP适配体核酸链能够特异性地识别并结合ATP并与其发生分子置换反应，且淬灭基团修饰的短链从所述传感单元上脱离；所述传感单元发生分子置换之前，荧光基团和猝灭基团之间发生共振能量转移，荧光基团在特定波长的激发光照射下无荧光信号发出；所述传感单元发生分子置换之后，荧光基团能在特定波长的激发光照射下发出荧光信号。
[0010]可选地，具有淬灭基团修饰的短链的长度小于具有荧光基团修饰的ATP适配体核酸链的长度。
[0011]可选地，所述基底结构上最远两点之间的距离为5nm
‑
15nm。
[0012]可选地，实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器还包括连接短链，所述连接短链的一端连接所述基底结构的端点，另一端连接传感单元；所述连接短链包括多个碱基。
[0013]根据本专利技术的第二方面，提供了一种实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器的应用，包括如下步骤：将纳米传感器与活细胞孵育培养，纳米传感器被胞吞进入活细胞内；当纳米传感器的传感单元检测到活细胞内的ATP后，传感单元发生分子置换反应；其中，传感单元的具有荧光基团修饰的ATP适配体核酸链特异性地识别并结合ATP，具有淬灭基团修饰的短链从所述传感单元上脱离；在特定波长的激发光照射下，活细胞内结合有ATP的传感单元出荧光信号；通过荧光显微镜对荧光信号进行观察，并通过酶标仪对荧光信号进行检测，以获取活细胞内ATP动态变化的实时监测结果。
[0014]可选地，所述活细胞为细胞系；或者，所述活细胞为来源于活体组织的原代细胞或干细胞；或者，所述活细胞为干细胞培养后的类器官。
[0015]可选地，通过荧光显微镜对荧光信号进行观察，包括：将活细胞放在共聚焦培养皿中培养过夜，并将稀释后的纳米传感器与活细胞在37℃无血清培养基中孵育2
‑
4小时，对处理后的活细胞进行保存，并采用共聚焦显微镜成像。
[0016]可选地，通过酶标仪对荧光信号进行检测，包括：将活细胞接种到细胞培养板中培养过夜；用无血清培养基将纳米传感器稀释至10nM并与细胞孵育，每预设时间检测一次激发波长为530nm，发射波长为570nm的荧光信号的荧光强度，并形成ATP波动变化曲线。
[0017]本专利技术的一个技术效果在于：在本申请实施例中，基底结构为由四条单链DNA经碱基互补配对形成的四面体框架结构，并能穿越活细胞膜；四个传感单元分别连接在基底结构的四个端点处，且传感单元能够在ATP参与下发生分子置换反应。进一步地，传感单元发生分子置换之前，传感单元在特定波长的激发光照射下无荧光信号发出；而传感单元发生分子置换之后，传感单元能在特定波长的激发光照射下发出荧光信号。因此，该实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器存在如下优点：（1）能够实现对活细胞的长期监测。在分子生物学领域和医学诊断领域中，其大大提高了监测装置与活细胞的生物相容性，不会对活细胞造成毒性损伤，保证脆弱细胞的高细胞活力，从而为对活细胞的监测带来了显著的优势。
[0018]（2）提高了监测装置进入活细胞的渗透效率。由于基底结构为由四条单链DNA经碱基互补配对形成的四面体框架结构，其特殊的形态以及大小相比于其他构型，可以以最大的效率被胞吞进入细胞，而无需其他转染方法辅助（例如化学转染，物理转染方法等等），从而能够较好地保护活细胞。当纳米传感器孵育活细胞时，可以主动进入活细胞内部，从而完成在活细胞内部的监测功能。
[0019]（3）提高了监测活细胞内ATP的灵敏度和特异性。四个传感单元分别连接在基底结构的四个端点处，相较于普通的ATP适配体检测链，其具有更高的灵敏度和特异性，保证了实时监测细胞内ATP的准确性。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器，其特征在于，包括：基底结构，所述基底结构为由四条单链DNA经碱基互补配对形成的四面体框架结构，并能穿越活细胞膜；传感单元，四个所述传感单元分别连接在所述基底结构的四个端点处；所述传感单元包括在ATP参与下发生分子置换反应的碱基对；所述传感单元发生分子置换之前，传感单元在特定波长的激发光照射下无荧光信号发出；所述传感单元发生分子置换之后，传感单元能在特定波长的激发光照射下发出荧光信号。2.根据权利要求1所述的实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器，其特征在于，四条单链DNA的摩尔数相同。3.根据权利要求1所述的实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器，其特征在于，所述传感单元由具有荧光基团修饰的ATP适配体核酸链与具有淬灭基团修饰的短链通过碱基互补配对结合而成；所述传感单元通过ATP适配体核酸链能够特异性地识别并结合ATP并与其发生分子置换反应，且淬灭基团修饰的短链从所述传感单元上脱离；所述传感单元发生分子置换之前，荧光基团和猝灭基团之间发生共振能量转移，荧光基团在特定波长的激发光照射下无荧光信号发出；所述传感单元发生分子置换之后，荧光基团能在特定波长的激发光照射下发出荧光信号。4.根据权利要求3所述的实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器，其特征在于，具有淬灭基团修饰的短链的长度小于具有荧光基团修饰的ATP适配体核酸链的长度。5.根据权利要求1所述的实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器，其特征在于，所述基底结构上最远两点之间的距离为5nm
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15nm。6.根据权利要求1所述的实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器，其特征在于，还包括连接短链，...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏泽文，张珂欣，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：