一种永生化口腔上皮细胞及其制备方法和应用技术

本申请涉及永生化细胞的技术领域，具体公开了一种永生化口腔上皮细胞及其制备方法和应用。本申请公开了永生化口腔上皮细胞的制备方法，具体包括以下步骤：利用SV40 LT过表达慢病毒对口腔上皮细胞进行细胞感染，经过细胞筛选、鉴定、传代，即得永生化口腔上皮细胞。利用本申请提供的制备方法能够快速获得永生化口腔上皮细胞，且永生化口腔上皮细胞的细胞密度和细胞活性较高。和细胞活性较高。和细胞活性较高。

【技术实现步骤摘要】
一种永生化口腔上皮细胞及其制备方法和应用


[0001]本申请涉及永生化细胞的
，具体涉及一种永生化口腔上皮细胞及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]抗核周因子是类风湿关节炎的相关自身抗体之一，当抗核周因子抗体显示阳性结果，表明患有类风湿关节炎的可能性较大。口腔上皮细胞作为抗核周因子抗体的靶抗原，能够用于抗核周因子抗体的检测，从而为类风湿关节炎提供早期特异的诊断指标，对疾病的判断及预后具有良好的提示作用。因此，口腔上皮细胞对于类风湿关节炎的研究具有重要的意义。
[0003]口腔上皮细胞的分离培养每次必须用到口腔上皮，制作程序繁琐，费时费力，而且各批次细胞间存在差异，不能保持细胞生理指标的稳定性；此外，细胞状态不易控制，且含有杂细胞，批次之间差异大，细胞病变不明显。因此，需要获得能够稳定传代的口腔上皮细胞，然而，口腔上皮细胞是一种终末分化的细胞，体外培养口腔上皮细胞存在很大的困难，且传代次数极为有限，当细胞传代一定次数后就会进入衰老期而不能继续增殖，极大的限制了口腔上皮细胞的研究和应用。
[0004]目前，永生化细胞能够使得细胞获得持续生长增殖能力的特性。然而，关于永生化口腔上皮细胞的研究报道很少。

技术实现思路

[0005]为了获得永生化口腔上皮细胞，同时能够提高永生化口腔上皮细胞的细胞密度和细胞活性，本申请提供一种永生化口腔上皮细胞及其制备方法和应用。
[0006]第一方面，本申请提供一种永生化口腔上皮细胞的制备方法，采用如下的技术方案：
[0007]一种永生化口腔上皮细胞的制备方法，具体包括以下步骤：
[0008]利用SV40 LT过表达慢病毒对口腔上皮细胞进行细胞感染，经过细胞筛选、鉴定、传代，即得永生化口腔上皮细胞。
[0009]优选地，所述口腔上皮细胞为人口腔上皮细胞。
[0010]本申请以人口腔上皮细胞作为宿主细胞，利用SV40 LT过表达慢病毒对人口腔上皮细胞进行细胞感染，使得SV40 LT基因与宿主细胞稳定整合重组，然后对经过细胞筛选与鉴定的口腔上皮细胞进行传代培养，能够获得稳定传代的永生化口腔上皮细胞。在此过程中，口腔上皮细胞中的抑癌基因与SV40 LT抗原片段上相关结合区域进行结合，使得口腔上皮细胞中的抑癌基因失效无法表达，从而防止了细胞分裂停滞，使其能够无限增殖；同时也能保留原始细胞的许多分化表型，具有相对稳定的增殖特性和功能状态，且获得的永生化口腔上皮细胞的细胞密度和细胞活性较高。
[0011]优选地，所述细胞感染的方法为：将所述口腔上皮细胞置于温度为10
‑
20℃的条件
下进行孵育，孵育时间为20
‑
40min，然后向所述口腔上皮细胞中加入SV40 LT重组慢病毒和感染增强剂，进行细胞感染。
[0012]在一个具体的实施方案中，所述温度可以为：10℃、15℃、20℃。
[0013]在一些具体的实施方案中，所述温度还可以为：10
‑
15℃、15
‑
20℃。
[0014]在一个具体的实施方案中，所述孵育时间可以为：20min、30min、40min。
[0015]在一些具体的实施方案中，所述孵育时间还可以为：20
‑
30min、30
‑
40min。
[0016]经过试验分析可知，在永生化细胞的制备过程中，相比于使用重组慢病毒直接对细胞进行感染，本申请选择在细胞感染前，将口腔上皮细胞置于温度为10
‑
20℃的条件下，孵育20
‑
40min，能够有效提高细胞的感染效率，从而有利于快速获得永生化口腔上皮细胞。
[0017]进一步地，所述SV40 LT过表达慢病毒为pBABE
‑
Puro SV40 LT慢病毒。
[0018]经过试验分析可知，当选择使用含有hTERT基因的端粒酶作为慢病毒，对细胞进行感染，原代细胞无法转化为永生化口腔上皮细胞；当选择使用同时含有pBABE
‑
Puro SV40 LT基因和hTERT基因的慢病毒对细胞进行感染，永生化口腔上皮细胞的转化成功率较低。而本申请选择使用pBABE
‑
Puro SV40 LT慢病毒，可以获得转化成功率较高的永生化口腔上皮细胞。因此，本申请选择使用pBABE
‑
Puro SV40 LT慢病毒对细胞进行感染。
[0019]进一步地，所述细胞感染的感染复数为MOI＝(5
‑
15)：1。
[0020]进一步地，所述感染增强剂为4
‑
8μg/mL的聚凝胺。
[0021]聚凝胺能够中和口腔上皮细胞表面唾液酸与重组慢病毒颗粒之间的静电排斥作用，促进重组慢病毒与口腔上皮细胞之间的吸附作用，从而显著提高重组慢病毒对口腔上皮细胞的感染效率。
[0022]在一个具体的实施方案中，所述聚凝胺的浓度可以为：4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL。
[0023]在一些具体的实施方案中，所述聚凝胺的浓度还可以为：4
‑
6μg/mL、6
‑
8μg/mL。
[0024]经过试验分析可知，当控制聚凝胺的浓度在上述范围内，能够进一步提高细胞的感染效率。因此，本申请将聚凝胺的浓度控制在上述范围。
[0025]优选地，所述细胞筛选包括一次筛选和二次筛选。
[0026]本申请通过确定细胞筛选中的杀灭曲线，发现嘌呤霉素的使用浓度为1.5μg/mL，作用时间为3d；因此，如果选择对感染的口腔上皮细胞仅进行一次筛选时，需要3d的时间才能获得感染成功的口腔上皮细胞。而本申请选择对感染的细胞进行了两次筛选，两次筛选的作用时间总共为12
‑
16h，即可获得感染成功的口腔上皮细胞，该结果表明本申请缩短了细胞筛选的时间，从而有利于快速获得永生化口腔上皮细胞。
[0027]另外，经过试验分析可知，当对感染的口腔上皮细胞仅进行一次筛选时，获得的永生化口腔上皮细胞的细胞密度和细胞活性较低；而本申请选择对感染的细胞进行了两次筛选，能够明显提高永生化口腔上皮细胞的细胞密度和细胞活性。
[0028]进一步地，所述一次筛选的方法为：将感染获得的口腔上皮细胞置于含0.5
‑
1.5μg/mL嘌呤霉素的培养基进行一次筛选，筛选时间为6
‑
10h。
[0029]在一个具体的实施方案中，所述一次筛选中嘌呤霉素的浓度可以为：0.5μg/mL、1.0μg/mL、1.5μg/mL。
[0030]在一些具体的实施方案中，所述一次筛选中嘌呤霉素的浓度还可以为：0.5
‑
1.0μg/mL、1.0
‑
1.5μg/mL。
[0031]经过试验分析可知，当控制一次筛选中嘌呤霉素的浓度在上述范围时，能够进一步提高细胞的细胞密度和细胞活性。因此，本申请将一次筛本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种永生化口腔上皮细胞的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：利用SV40 LT过表达慢病毒对口腔上皮细胞进行细胞感染，经过细胞筛选、鉴定、传代，即得永生化口腔上皮细胞。2.根据权利要求1所述的永生化口腔上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述细胞感染的方法为：将所述口腔上皮细胞置于温度为10
‑
20℃的条件下进行孵育，孵育时间为20
‑
40min，然后向所述口腔上皮细胞中加入SV40 LT重组慢病毒和感染增强剂，进行细胞感染。3.根据权利要求2所述的永生化口腔上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述SV40 LT过表达慢病毒为pBABE
‑
Puro SV40 LT慢病毒。4.根据权利要求2所述的永生化口腔上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述细胞感染的感染复数为MOI=（5
‑
15）：1。5.根据权利要求2所述的永生化口腔上皮细胞的制备方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱京山，
申请(专利权)人：北京和杰创新生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：